PLoS：构建植物ihpRNA新方法

　　来自中科院华南植物园，中国热带农业科学院等处的研究人员发表了题为“High-Throughput Construction of Intron-Containing Hairpin RNA Vectors for RNAi in Plants”的文章，设计出了一种基于Golden Gate克隆技术构建含内含子发夹结构RNA（ihpRNA）表达载体的新方法。相关成果公布在国际学术期刊PLoS ONE上。

　　生物通报道：来自中科院华南植物园，中国热带农业科学院等处的研究人员发表了题为“High-Throughput Construction of Intron-Containing Hairpin RNA Vectors for RNAi in Plants”的文章，设计出了一种基于Golden Gate克隆技术构建含内含子发夹结构RNA（ihpRNA）表达载体的新方法。相关成果公布在国际学术期刊PLoS ONE上。

文章的通讯作者是华南植物园华南农业植物遗传育种重点实验室段俊研究员，以及中国热带农业科学院周鹏，第一作者是博士生言普。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是通过双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)介导，特异性地降解靶mRNA，使同源的靶基因发生沉默，即序列特异性转录后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing，PTGS)，从而诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。RNAi现象普遍存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。如真菌的静息作用、植物的转录后基因沉默、动物的RNAi，虽然在不同物种中的名称不同，但其分子机制极其相似。

自从发现双链RNA能引发RNA干扰现象后，RNAi已经成为分析基因功能的重要工具之一。随着RNAi技术在植物基因功能分析上的广泛应用，迫切需要一种高通量构建发夹RNA（hpRNA）表达载体的方法。

在这篇文章中，研究人员设计出了一种基于Golden Gate克隆技术构建含内含子发夹结构RNA（ihpRNA）表达载体的新方法。利用该方法，只需在扩增靶基因序列的同时，由引物在序列两端加上相应的BsaI识别和切割位点，经一步酶切/连接反应后，此靶基因片段能同时以正向和反向的位置克隆到pRNAi-GG，形成ihpRNA表达载体结构。

而且整个构建过程只需在一管中通过一个反应完成，构建效率高，且无背景干扰，同时由于pRNAi-GG为植物双元表达载体，构建好的ihpRNA表达载体可直接用于农杆菌转化研究。这一载体构建方法具有简单、快速、高效和成本低等优点，为大规模的植物功能基因研究提供了一个高通量的平台。

之前的研究曾表明，用含有内含子的发夹RNAi结构表达dsRNA的植物中，90%表现出沉默效应，而用发夹RNA(Hairpin RNA，hpRNA)、正义和反义结构分别仅有58%、13%和12%的沉默效应。因此针对ihpRNA的研究，逐渐受到了科学家们的关注。

曾有研究人员利用Gateway重组克隆技术，构建高通量基因沉默的载体系列pHELLSGATE，包括全部拟南芥基因组的ihpRNA转基因系。还有科学家也根据Gateway技术开发了一种专门针对水稻基因组功能分析的RNA干扰载体-pANDA。还有用于高通量植物功能基因组构建的载体系列，包括适合组成型表达、诱导型异常表达的GUS或GFP融合蛋白双元载体，和以烟草花叶病毒为基础构建的高通量VICS载体系列。

（生物通：万纹）

原文摘要：

High-Throughput Construction of Intron-Containing Hairpin RNA Vectors for RNAi in Plants

With the wide use of double-stranded RNA interference (RNAi) for the analysis of gene function in plants, a high-throughput system for making hairpin RNA (hpRNA) constructs is in great demand. Here, we describe a novel restriction-ligation approach that provides a simple but efficient construction of intron-containing hpRNA (ihpRNA) vectors. The system takes advantage of the type IIs restriction enzyme BsaI and our new plant RNAi vector pRNAi-GG based on the Golden Gate (GG) cloning. This method requires only a single PCR product of the gene of interest flanked with BsaI recognition sequence, which can then be cloned into pRNAi-GG at both sense and antisense orientations simultaneously to form ihpRNA construct. The process, completed in one tube with one restriction-ligation step, produced a recombinant ihpRNA with high efficiency and zero background. We demonstrate the utility of the ihpRNA constructs generated with pRNAi-GG vector for the effective silencing of various individual endogenous and exogenous marker genes as well as two genes simultaneously. This method provides a novel and high-throughput platform for large-scale analysis of plant functional genomics.

作者简介：

段俊
职务: 遗传育种研究组首席科学家
职称: 研究员

6/2002– 现在: 研究员，中国科学院华南植物园，中国广州
10/1998 – 6/2002: 副研究员，中国科学院华南植物所，中国广州
10/2001 – 10/2000: 访问学者，日本东京大学，日本东京
8/1995 – 9/1998:　助理研究员，中国科学院华南植物所，中国广州
7/1988 – 7/1995:　实习研究员，中国科学院华南植物所，中国广州

研究领域：
植物遗传育种
社会任职：
广东省品种审定委员会委员