CRISPR掀起基因组编辑的热潮

　　研究人员迅速将重点放在CRISPR系统的基因编辑潜力，让它们切割精确位置的DNA，甚至是几个位置，这样他们就能检验细胞内突变的影响。而一些公司也开始商业化这种技术，因为它比目前的基因编辑工具更容易产生，也更便宜。

　　

来源：GEN
作者：Patricia Fitzpatrick Dimond, Ph.D.

自CRISPR热潮开始以来，科学家们就一直专注于改变系统精确而可靠的DNA切割，使其适用于遗传改造。

CRISPR于1987年出现于日本，当时的研究人员报告称，他们在大肠杆菌基因组中发现了一种不寻常的结构，其中包含一系列重复片段，中间以独特的间隔序列隔开。后来的研究表明，间隔序列对应了感染细菌细胞的噬菌体的序列。在一些原核生物和古生物中，CRISPR和CRISPR相关蛋白（Cas）作为一种适应性免疫系统，抵御入侵的噬菌体和质粒。在之后的文章中，科学家将CRISPR系统描述成一种独特的RNA沉默系统，通过RNA的同源依赖切割来起作用。

正如Bhaya等人所述，CRISPR系统让宿主细菌细胞能够特异地将入侵遗传元件（病毒或质粒）的短序列掺入其基因组区域，其中包含规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）。当这些序列被转录并加工成小RNA时，它们引导一种多功能的蛋白复合物（Cas蛋白）来识别并切割外来的遗传物质。据研究人员介绍，这种适应性免疫系统使用一个非编码小RNA库作为武器，来对付迅速变化的病毒，也作为宿主的调控系统。

研究人员迅速将重点放在这一系统的基因编辑潜力，让它们切割精确位置的DNA，甚至是几个位置，这样他们就能检验细胞内突变的影响。而一些公司也开始商业化这种技术，因为它比目前的基因编辑工具更容易产生，也更便宜。

Cas9的巨大潜力

2012年，霍华德•休斯研究所的Jennifer Doudna博士及一些同事提出，他们的研究发现一组核酸内切酶使用双链RNA进行位点特异的DNA切割，并强调这一系统可用于基因组编辑。

在2012年8月的《Science》在线版上，研究小组鉴定出DNA干扰机制，其中涉及到双链RNA结构，它指导Cas9核酸内切酶来引入目标DNA上的双链断裂。

研究人员发现，成熟的crRNA与反式激活的crRNA（tracrRNA）形成双链RNA结构，它指导CRISPR相关蛋白Cas9在目标DNA上引入双链断裂。在与crRNA指导序列互补的位点，Cas9 HNH核酸酶结构域切割互补的链，而Cas9 RuvC-like结构域切割非互补链。

tracrRNA:crRNA指导的Cas9蛋白利用不同的核酸酶结构域（HNH和RuvC-like结构域）来切割目标DNA上的两条链。Cas9的目标识别需要crRNA上的种子序列以及包含GG二核苷酸的PAM序列，它与DNA目标上crRNA的结合区域相邻。作者进一步表明，Cas9核酸内切酶可编程，以切割任何感兴趣的dsRNA。

科学家认为，通过改变向导RNA的DNA结合序列，这一系统是高效、灵活且可编程的。他们指出，尽管ZFN和TALEN引起了人们的兴趣，但他们提出了一种基于RNA编程的Cas9的新方法，可为基因定位和基因组编辑应用提供相当大的潜力。

根据这一篇及其他文章，《Science》将CRISPR技术选为2012年度突破性技术的亚军，预计将让研究人员从实验上检验各种可能的致病突变的影响，并产生人类疾病的动物模型。

迄今为止，这一领域的研究工作进展迅速，因为研究人员已找到方法将其应用在果蝇、酵母、斑马鱼和小鼠受精卵中。

增强版本

很多科学家都对这项技术表现出了极大热情，尽管它也有一些缺点，比如脱靶效应。

今年8月，Broad研究院的一个研究团队带来了增强版的技术，与之前的操作相比，它降低了脱靶位点的编辑活性。F. Ann Ran及其同事证明，在人类细胞中，通过配对切刻（paired nicking），可将脱靶活性减少50-1500倍，并有助于小鼠受精卵的基因敲除。这种策略用途广泛，能应用于需要高特异性的基因组编辑研究中。

Ran及其同事从ZFN和TALEN系统中获得提示，它们是利用两个独立的DNA结合模块来控制特异性。研究小组为CRISPR-Cas9系统开发出一种类似的方法，利用特异配对的向导RNA，它们与目标位点上相对的DNA链结合，以及Cas9的突变版本。

而生物技术公司也在商业化CRISPR技术，押宝CRISPR的广泛采用将促进DNA编辑，并改变基因插入研究的开展方式。

双链切刻（Double Nicking）

加州伯克利的Caribou Biosciences公司正在开发一种基于细菌核酸酶Cas9的技术，它以序列特异的方式产生双链DNA的断裂。

Caribou的联合创始人和CEO Rachel Haurwitz博士谈道：“Cas9-sgRNA的效率和易用性已在多个细胞类型和物种中实现了快速而激动人心的工作，但特异性的问题一直是个困扰。对于这项技术的某些应用，特异性无疑需要改善，而双链切刻策略就是个很好的例子。”

Haurwitz博士告诉《GEN》，“CRISPR技术有着广泛的适用性；我们已经看到了学术和商业领域的一些活动，这些试剂及试剂盒将实现位点特异的改造。”此外，她预计，作为人类疾病模型的改造动物也有越来越多的需求。“我们正与SAGE实验室合作，让SAGE可以为研究人员提供更多的动物模型及服务。”

除了短期的科研应用，Haurwitz博士还表示：“我们认为会广泛应用在微生物的菌株改造、农业生物技术，以及人类治疗，特别是基因治疗。”

今年9月，SAGE实验室宣布它与Caribou签订了合作与授权协议，主要是关于CRISPR/Cas9基因组编辑系统的知识产权。

这项协议让SAGE实验室独家拥有Caribou的知识产权来生产和出售遗传改造大鼠，以及小鼠和兔模型的非独家授权。该公司表示，Cas9系统将与SAGE的ZFN技术互补，让SAGE为客户提供人类疾病的新型动物模型。

与此同时，随着这项技术更加完美，我们预计CRISPR领域的活动将继续增加。

（生物通 编译）

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