Nature子刊：强大基因编辑工具可引起脱靶突变

　　在过去的一年里，一组称作为CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶（RNA-guided nucleases，RGNs）的合成蛋白被用作为基因编辑工具，让科学团体陷入极大的兴奋。利用这一某些细菌用以对抗病毒和其他病原体的方法，CRISPR-Cas RGNs可在特异位点切断DNA链，由此插入新的遗传物质。

　　

生物通报道 在过去的一年里，一组称作为CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶（RNA-guided nucleases，RGNs）的合成蛋白被用作为基因编辑工具，让科学团体陷入极大的兴奋。利用这一某些细菌用以对抗病毒和其他病原体的方法，CRISPR-Cas RGNs可在特异位点切断DNA链，由此插入新的遗传物质。

然而，近日来自麻省总医院（MGH）的研究人员发现了使用CRISPR-Cas RGNs一个重要的局限：会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。这项研究在线发表在6月23日的《自然生物技术》（Nature Biotechnology）杂志上。

论文的共同资深作者、麻省总医院病理系研究副主任J. Keith Joung博士说：“我们发现，在人类细胞中表达CRISPR-Cas RGNs可产生脱靶效应。相比于其他的基因组编辑技术，RGNs仍然具有巨大的优势，但这些研究发现将我们的研究焦点放到了提高它们的精确度上。”

CRISPR-Cas RGNs是由一种叫做Cas 9的DNA切割酶，与一段与靶DNA片段匹配的20个核苷酸长度的短RNA片段构成，它模拟了某些细菌的原始免疫系统。当这些微生物受到病毒或其他生物体的感染时，它们会拷贝入侵者的一段遗传密码，将它插入到自身的DNA中，并传递给细菌后代。如果在未来遇到相同的病原体，细菌的Cas9在与拷贝DNA片段匹配的RNA序列的引导下，通过在靶位点切割病原体的DNA而灭活它。

大约在一年前，科学家们报告称首次利用重编程的CRISPR-Cas RGNs，靶向并切割了特异的DNA位点。自那时起，包括Joung研究小组在内的数个研究团体，都成功利用CRISPR-Cas RGNs在果蝇、斑马鱼、小鼠和人类细胞（包括多能干细胞）中实现了基因组改造。该技术依靠一段短的RNA片段，使得CRISPR-Cas RGNs相比于锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFNs）和转录激活因子样效应.物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)等其他的基因编辑工具更容易使用，并且通过重编程RGNs可以同时导入几种遗传改变。

然而，一直以来都基本无人探讨CRISPR-Cas RGNs可能引起额外的不必要遗传改变的可能性，于是Joung研究小组开始着手调查在表达CRISPR-Cas RGNs的人类细胞中“脱靶”基因的发生情况。由于引导RNA片段和靶DNA之间的相互作用仅仅依靠于20个核苷酸，他们推测RNA有可能会识别与靶DNA存在几个核苷酸差异的DNA片段。

尽管以往的研究发现，单核苷酸错配可以阻止某些CRISPR-Cas RGNs起作用，麻省总医院研究小组在人类细胞系实验中发现了多个例子，证实 5个核苷酸的错配不会妨碍切割一段脱靶DNA片段。他们还发现，脱靶位点的突变率有可能和靶位点一样高，或甚至更高，但却未发现与ZFNs（索取锌指核酸酶相关产品资料 ）或TALENs（索取GeneArt Precision TAL的更多信息）相关的脱靶突变。

Joung 说：“我们的研究结果并不意味着，RGNs不能成为重要的研究工具，而是表明研究人员需要在他们的实验中考虑这些潜在的混杂效应。它们还表明，现有的RGN平台或许不适合治疗应用。我们现正致力于找到一种方法减少这些脱靶效应，以及开发一些方法鉴别人类细胞中任何给定RGN的所有潜在脱靶位点，这样我们就可以评估开发的第二代RGN平台是否确实在全基因组水平上更为精确。我乐观地认为，我们可以进一步的操纵这一系统，获得更好的特异性，因而有可能将之应用于人类疾病治疗。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells

Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat (CRISPR) RNA-guided nucleases (RGNs) have rapidly emerged as a facile and efficient platform for genome editing. Here, we use a human cell–based reporter assay to characterize off-target cleavage of CRISPR-associated (Cas)9-based RGNs. We find that single and double mismatches are tolerated to varying degrees depending on their position along the guide RNA (gRNA)-DNA interface. We also readily detected off-target alterations induced by four out of six RGNs targeted to endogenous loci in human cells by examination of partially mismatched sites. The off-target sites we identified harbored up to five mismatches and many were mutagenized with frequencies comparable to (or higher than) those observed at the intended on-target site. Our work demonstrates that RGNs can be highly active even with imperfectly matched RNA-DNA interfaces in human cells, a finding that might confound their use in research and therapeutic applications.