南开大学陈凌懿教授发表CRISPR新成果

　　利用抗生素进行筛选，是分子克隆的一个关键步骤。日前，南开大学的研究者们以CRISPR/Cas技术为基础，开发了一个重复利用抗生素抗性的简单筛选方法，这一方法非常适用于多步骤的基因工程改造。

　　

生物通报道：利用抗生素进行筛选，是分子克隆的一个关键步骤。日前，南开大学的研究者们以CRISPR/Cas技术为基础，开发了一个重复利用抗生素抗性的简单筛选方法，这一方法非常适用于多步骤的基因工程改造。

对于一个分子生物学实验室来说，抗生素抗性基因几乎是不可或缺的。虽然这些基因是鉴定正确克隆的有力工具，但抗生素抗性基因有数量限制，束缚了人们进行复杂基因工程改造的能力。

南开大学生命科学学院的陈凌懿教授在四月份的BioTechniques杂志上发表文章，描述了一个在几轮克隆中重复进行一种抗生素筛选的简单方案。这一技术将为哺乳动物细胞的基因工程改造带来可喜改变。

去除抗生素抗性基因，就可以在进一步基因改造时，继续使用同一种抗生素进行筛选。为此，研究人员采用了被称为CRISPR/Cas的新技术。CRISPR/Cas是一个新兴的基因组编辑工具，能够定向切割特定的DNA片段。（相关文章：Nature子刊：巧解基因编辑脱靶问题）

陈教授的研究团队通过软件搜索了针对嘌呤霉素抗性基因puro的引导序列，引导序列负责将CRISPR/Cas机器引导到正确的靶点。他们选择了脱靶效应最小的引导序列，并将其克隆到相应的质粒上与Cas9共表达。

研究人员通过CRISPR/Cas系统，在小鼠胚胎干细胞系中破坏了嘌呤霉素抗性基因，并使用PCR和测序验证了puro基因中的缺失。随后，他们用含有puro基因的载体转染这些细胞，恢复了进行嘌呤霉素抗性筛选的能力。

在此之前，人们一般用Cre-loxP或Flp-FRT重组系统去除抗生素筛选基因。但陈教授认为，CRISPR/Cas系统更加实用。“我们的方案最适合于多步骤的基因组工程改造。尤其是当抗生素抗性基因两侧没有预先设计LoxP或FRT位点时。”

尽管CRISPR/Cas的应用近来已经发表了不少文章，陈教授认为这还只是一个开端。“研究显示，CRISPR/Cas技术是一个有力的基因组编辑工具，可以完成常规或条件性的基因敲除和敲入。可以想见，最终人们将能利用CRISPR/Cas技术在患者体内校正基因缺陷和突变。”

陈凌懿教授简介：

所属部门：遗传学和细胞生物学系

招生专业：细胞生物学

研究方向：小鼠胚胎早期发育中转录编程的调控机制；胚胎干细胞的发育多能性的分子机制；建立诱导

1999        北京大学  学士

2004        美国西北大学  博士

2005--2008   美国哈佛大学  博士后

2008--      南开大学生命科学学院  教授、博导

 

生物通编辑：叶予

生物通推荐原文摘要：

Inactivation of an integrated antibiotic resistance gene in mammalian cells to re-enable antibiotic selection

Removing an antibiotic resistance gene allows the same antibiotic to be re-used in the next round of genetic manipulation. Here we applied the CRISPR/Cas system to disrupt the puromycin resistance gene in an engineered mouse embryonic stem cell line and then re-used puromycin selection in the resulting cells to establish stable reporter cell lines. With the CRISPR/Cas system, pre-engineered sequences, such as loxP or FRT, are not required. Thus, this technique can be used to disrupt antibiotic resistance genes that cannot be removed by the Cre-loxP and Flp-FRT systems.