高产科学家发表CRISPR-Cas9技术新应用

【字体: 时间:2015年01月26日 来源:生物通

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  最近,加州大学圣地亚哥医学院细胞和分子医学系教授Steven F. Dowdy博士带领的研究小组,在国际著名学术期刊《Nucl Acids Res》发表一项研究,开发出一种高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重组方法,通过将表型突变加选择性siRNA位点同时引入一个基因的一个等位基因中,来研究哺乳动物的基因功能。

  

生物通报道:加州大学圣地亚哥医学院细胞和分子医学系教授Steven F. Dowdy博士长期以来从事细胞周期和蛋白质转导领域的研究工作。最近,他带领的课题组先后在多家国际著名学术期刊发表重要研究成果。

在2014年7月份,该课题组在《eLife》发表的一篇论文中表示,他们发现在调控细胞周期进程中起至关重要作用的一种蛋白并非以往认为的、导致一个重要的肿瘤抑制因子失活,而是激活了它。这一研究发现是该研究小组差不多20年研究工作的结果,它完全颠覆了原来所认为的:在癌症中一种叫做p16-cyclin D的最常见遗传信号通路突变驱动了所有癌细胞中细胞周期进程的一个基本方面。相关阅读:20年研究颠覆癌症教条。接着在11月份,该小组在Nature旗下子刊《Nature Biotechnology》发表了他们所开发的一种新技术:采用化学方法来伪装RNAi药物,使得它们能够进入到细胞中。一旦进入,细胞机器会将这些伪装的药物前体siRNNs转变为活性RNAi药物。相关阅读:Nature子刊:开发新一代RNAi疗法

新年伊始,该课题组又在国际著名学术期刊《Nucl Acids Res》发表题为“Efficient CRISPR-rAAV engineering of endogenous genes to study protein function by allele-specific RNAi”的论文。在这项研究中,研究人员开发出一种高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重组方法,通过将表型突变加选择性siRNA位点同时引入一个基因的一个等位基因中,来研究哺乳动物的基因功能,可允许在同一细胞中进行野生型和突变型蛋白的表达。

研究哺乳动物基因功能的经典方法是,用遗传学手段敲除基因或用RNAi删除mRNA,从而去除感兴趣的蛋白,来诱导一种表型。为了确认所靶定的基因是否为诱变基因,我们需要修复相同基因一个变异体的异位表达所引起的功能表型缺失。遗憾的是,组成型基因敲除可激活一种显著损害表型和基因功能的代偿机制。

相反,急性RNAi介导的基因缺失可以揭示更多的功能,并带来一个更为详细的分子机制。然而,修复基因缺失或损耗,同样充满了潜在危险。通常使用蛋白质表达系统——包括诱导型启动子下面稳定的整合基因组结构,往往会显著过度表达修复的蛋白质,从而改变蛋白质-蛋白质间相互作用的化学计量,并可能导致潜在的假阳性“修复”结果。而缺乏适当的基因调控,可以通过使用小基因或细菌人工染色体得以解决,这些方法对细胞来说是一种人造情况。

为了弥补这一差距,该研究小组开发出一种高效的CRISPR/Cas9和rAAV靶向基因重组方法,通过将表型突变加上选择性siRNA位点同时引入一个基因的一个等位基因中,来研究哺乳动物的基因功能,可允许在同一细胞中野生型和突变型蛋白的表达。

通过转染相应的表达质粒和筛选siRNA序列,研究人员可容易地识别沉默的点突变,以产生siSN序列。rAAV和等位基因特异性siRNA相结合,可让我们选择性地研究相同遗传学背景中内源条件下表达和调控的单倍不足(siSN)和突变体(siWT)。更重要的是,最近一项单细胞RNA-seq研究确定,76%到88%的人类常染色体基因是双等位基因,只有12%到24%的是单等位基因。这表明,该研究小组开发的CRISPR–Cas9和 rAAV方法,应该能够适用于人类基因组中绝大部分的基因。

总的来说,这种CRISPR加rAAV方法,对于研究内源基因功能具有广泛的适用性,大大克服了经典基因修复方法的相关问题。

(生物通:王英)

延伸阅读:刘小乐等:分析CRISPR/Cas9敲除的新算法

生物通推荐原文摘要:
Efficient CRISPR-rAAV engineering of endogenous genes to study protein function by allele-specific RNAi
Abstract: Gene knockout strategies, RNAi and rescue experiments are all employed to study mammalian gene function. However, the disadvantages of these approaches include: loss of function adaptation, reduced viability and gene overexpression that rarely matches endogenous levels. Here, we developed an endogenous gene knockdown/rescue strategy that combines RNAi selectivity with a highly efficient CRISPR directed recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) mediated gene targeting approach to introduce allele-specific mutations plus an allele-selective siRNA Sensitive (siSN) site that allows for studying gene mutations while maintaining endogenous expression and regulation of the gene of interest. CRISPR/Cas9 plus rAAV targeted gene-replacement and introduction of allele-specific RNAi sensitivity mutations in the CDK2 and CDK1 genes resulted in a >85% site-specific recombination of Neo-resistant clones versus ∼8% for rAAV alone. RNAi knockdown of wild type (WT) Cdk2 with siWT in heterozygotic knockin cells resulted in the mutant Cdk2 phenotype cell cycle arrest, whereas allele specific knockdown of mutant CDK2 with siSN resulted in a wild type phenotype. Together, these observations demonstrate the ability of CRISPR plus rAAV to efficiently recombine a genomic locus and tag it with a selective siRNA sequence that allows for allele-selective phenotypic assays of the gene of interest while it remains expressed and regulated under endogenous control mechanisms.

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