武汉大学：建立体外高效CRISPR/Cas9靶向DNA编辑系统

　　当前，CRISPR/ Cas9系统已被广泛应用于各种生物体中实现特异的基因组编辑。相比之下，少有研究报道体外应用CRISPR/Cas9系统。来自武汉大学药学院的研究人员称，他们建立起了一个体外高效CRISPR/Cas9介导编辑(ICE)系统。这一研究成果发布在11月10日的《mBio》杂志上。

　　

生物通报道  当前，CRISPR/ Cas9系统已被广泛应用于各种生物体中实现特异的基因组编辑。相比之下，少有研究报道体外应用CRISPR/Cas9系统。来自武汉大学药学院的研究人员称，他们建立起了一个体外高效CRISPR/Cas9介导编辑(ICE)系统。这一研究成果发布在11月10日的《mBio》杂志上。

领导这一研究的是武汉大学药学院的孙宇辉（Yuhui Sun）教授。孙教授2010年从剑桥大学回国任教，并入选湖北省楚天学者特聘教授，其主要研究领域为微生物来源天然产物生物合成的分子遗传学、生物化学及合成生物学。

近一个世纪以来，微生物天然产物是药物发现与开发的一个热点，为人们提供了包括抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂和杀虫剂在内的一些有价值的疗法。发现并确定生成这些生物活性代谢产物的生物合成基因簇的特征，对于开发出基于天然产物的新药至关重要。新一代测序微生物基因组取得的一些新进展，提供了有关潜在次级代谢产物信号通路的大量信息。但许多的基因簇看似沉默，且这些基因簇的大小(50 -130 kb)阻碍了操控它们。因此，需要一些有效的新方法来增进我们对这些生物合成信号通路认识。

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传统的生物合成基因簇分析依赖于通过同源重组进行体内基因编辑，最近异源表达基因簇成为了一种有价值的替代方法，用于选择来自遗传上难操控菌株或来自无法培养的微生物宏基因组学分析的基因组簇。然而，将基因簇克隆到粘粒上是一个较慢的过程，且不适于较大的基因簇。因此，需要一种快速、特异且无缝的DNA编辑系统来实现对生物合成基因簇的功能调查。

近年来，CRISPR/ Cas系统作为一种适应性微生物免疫系统被发现，现已广泛用于许多模式生物中实现体内高度有效、特异地编辑基因组。来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的CRISPR/Cas系统是由Cas9和两条RNAs（crRNA和tracrRNA）构成，当前最为常用（延伸阅读：Nature：揭示CRISPR/Cas9的DNA靶向切割机制  ）。尽管CRISPR/Cas9系统已多次证实，可以高效且特异性地编辑各种生物的染色体，被广泛用于动物模型和非动物研究中，在体外应用CRISPR/Cas9系统来设计及重构DNA片段得到的关注就少得多。

在这里，武汉大学的研究人员报告称构建了一种高效的体外CRISPR/Cas9介导编辑(ICE)系统，其允许特异性重构生物合成基因组簇及其他大DNA片段。研究人员以Cas9切割环状pUC18 DNA作为一个小模型进行调查，揭示出Cas9的3′→5′外切核酸酶活性在编辑接合处生成了随机缺失5-14个核苷酸(nt)的错误。他们采用T4 DNA聚合酶修复Cas9生成的粘性末端，大大提高了编辑精度。采用ICE系统，研究人员分别在包含抗生素RK-682和全霉素完整生物合成基因簇的pYH285质粒和10A3粘粒中，删除了rkD和homE基因。此外，还成功将氨苄西林抗药性基因(bla)插入到了pYH285中。

研究结果证实了，这一ICE系统是一种快速、无缝、高效DNA片段编辑方法，及调查和操控生物合成基因簇的一种强大的新工具。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

In Vitro CRISPR/Cas9 System for Efficient Targeted DNA Editing.doi: 10.1128/mBio.01714-1510 November 2015 mBio vol. 6 no. 6

The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) system, an RNA-guided nuclease for specific genome editing in vivo, has been adopted in a wide variety of organisms. In contrast, the in vitro application of the CRISPR/Cas9 system has rarely been reported. We present here a highly efficient in vitro CRISPR/Cas9-mediated editing (ICE) system that allows specific refactoring of biosynthetic gene clusters in Streptomyces bacteria and other large DNA fragments……

作者简介：

孙宇辉

博士、楚天学者特聘教授、博士生导师、院长助理
武汉大学药学院“组合生物合成与新药发现教育部重点实验室”主任

学习简历
1988.9―1992.7    江西农业大学  攻读植物遗传育种专业学士学位
1997.9―2001.3    华中农业大学  攻读生物化学与分子生物学专业硕士学位
2001.3―2004.3    上海交通大学  攻读生物化学与分子生物学专业博士学位

工作简历
1992.7―1998.9    江西农业大学 生物技术研究开发中心  研究实习员（初级）
1998.9―2002.10   江西农业大学 生物技术研究开发中心  助理研究员（中级）
2002.10―2006.11  江西农业大学 生物工程系  副教授
2006.11―2009.11  江西农业大学 生物工程与技术学院  教授
2005.1―2010.5    剑桥大学 生物化学系 Royal Society China Fellow，Senior Research Associate
2010.5―          武汉大学 药学院  楚天学者特聘教授

业绩概要
对具有重要基础和应用价值的活性天然产物的生物合成机制及其分子改造进行了多年的探索和积累，在国外权威学术期刊，如“Nature Chemical Biology”、 “Angewandte Chemie International Edition”、“Chemistry & Biology”等发表研究论文多篇。此外，合作编译国外专业教材一部，获国家发明专利2项和多项国家、省（部）级奖励。

获奖情况
国家自然科学二等奖（2008）、江西省高校科技成果一等奖（2007）、江西省自然科学二等奖（2007）、全国优秀博士论文提名奖（2006）、上海市研究生优秀成果(学位论文)奖（2006）、上海市科技进步一等奖（2004）

学术兼职
“微生物代谢国家重点实验室（上海交通大学）”第一届学术委员会委员（2012年1月-2016年12月）
湖北省药学会第十二届理事会生化制药专业委员会委员（2013年4月-2017年3月）

研究领域：微生物来源天然产物生物合成的分子遗传学、生物化学及合成生物学

研究兴趣与方向：基于微生物来源的活性天然产物生物合成途径的发现与开发。