华人学者连发CRISPR研究成果

　　最近，来自美国德克萨斯理工大学健康科学中心的吴浩泉（音译，Haoquan Wu）带领的研究小组，分别在国际学术期刊《Cell Reports》和《Genome Biology》发表两项有关CRISPR的重要研究成果。

　　

生物通报道：最近，来自美国德克萨斯理工大学健康科学中心的吴浩泉（音译，Haoquan Wu）带领的研究小组，分别在国际学术期刊《Cell Reports》和《Genome Biology》发表两项有关CRISPR的重要研究成果。延伸阅读：刘小乐教授：CRISPR高通量筛选的新算法。

西尼罗河病毒（WNV）是黄病毒科黄病毒属的重要成员，是一种通过蚊子传播的嗜神经病原体。西尼罗河病毒最早是1937年在乌干达一位发热妇女的血液中分离到。这种病毒在非洲、欧洲、中东、北美和西亚很常见，人类、马和其他哺乳动物都可能受到感染。

西尼罗河病毒感染往往伴随着大量的神经细胞死亡。然而，人们对这种病毒诱导细胞死亡的机制还并不了解。鉴于此，Haoquan Wu和N. Manjunath领导研究团队，开发了一个基于CRISPR-Cas9的筛选方法，鉴定了WNV诱导细胞死亡所必需的基因。这项研究发表在七月十六日的《Cell Reports》杂志上。

研究人员以20,121个基因为靶标，建立了包含77,406个sgRNA的文库。他们先用这个文库进行全基因组筛选，然后用一个亚文库进行了二次筛选。研究指出，两轮筛选可以提高实验的灵敏度和特异性。研究人员鉴定了WNV诱导细胞死亡所必需的七个基因：EMC2、EMC3、SEL1L、DERL2、UBE2G2、UBE2J1和HRD1。研究表明，敲除这些基因可以对细胞起到很强的保护作用。值得注意的是，敲除这些基因并不会阻止WNV复制。这些基因的作用应该是把WNV复制与下游的细胞死亡通路关联起来。另外，这七个基因都属于内质网相关蛋白降解（ERAD）通路，说明该通路可能是WNV诱导细胞死亡的主要驱动者。

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12月15日，Haoquan Wu带领的研究小组又在国际学术期刊《Genome Biology》发表题为“Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency”的研究成果。对CRISPR/Cas系统中的sgRNA结构进行了优化，以提高CRISPR-Cas9的基因敲除效率。

单导向RNA（sgRNA）是CRISPR-Cas9基因编辑系统两个关键组分的其中一个。与原生的细菌CRISPR RNA（crRNA）相比，目前常用的sgRNA结构具有一个缩短的双链——反式激活crRNA（tracrRNA）双链，并包含一段连续的胸腺嘧啶序列，是RNA聚合酶III的停止信号，从而可能会降低转录效率。

在这项研究中，研究人员系统地研究了这两个要素对基因敲除效率的影响，他们发现，通过扩展双链长度和改变胸腺嘧啶到胞嘧啶或鸟嘌呤的连续序列的第四个胸腺嘧啶，而对sgRNA做出的修饰，有时可以显著提高细胞的基因敲除效率。此外，优化sgRNA结构也显著增加了更具挑战性的基因组编辑程序的效率，如基因缺失，这对于非编码基因中的诱性功能缺失，是非常重要的。

总而言之，通过对sgRNA结构进行系统的调查研究，该研究小组发现，将双链延伸大约5bp，结合改变位置4到胞嘧啶或鸟嘌呤上的胸腺嘧啶连续序列，可显著增加CRISPR-Cas9基因组编辑实验的基因敲除效率。

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biol. 2015 Dec 15;16:280. doi: 10.1186/s13059-015-0846-3.

A CRISPR-Based Screen Identifies Genes Essential for West-Nile-Virus-Induced Cell Death. Cell Rep. 2015 Jul 28;12(4):673-83. doi: 10.1016/j.celrep.2015.06.049. Epub 2015 Jul 16.