Nature揭示Cas9全新作用

　　来自洛克菲勒大学的一项研究在2月18日的《自然》（Nature）杂志上，提供了细菌分子免疫系统发挥作用在微生物基因组中编码病毒DNA，将其日后用作为病毒切割酶的指南，这一神秘过程的一些新见解。

　　

生物通报道  细菌或许没有大脑，但它们确实有记忆，至少在涉及攻击它们的病毒时是如此。许多细菌都拥有一种分子免疫系统，使得这些微生物能够捕获和保留过去遭遇到的一些病毒DNA片段，以便当其再度出现时可以识别和破坏它。

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来自洛克菲勒大学的一项研究在2月18日的《自然》（Nature）杂志上，提供了这一系统发挥作用在微生物基因组中编码病毒DNA，将其日后用作为病毒切割酶的指南，这一神秘过程的一些新见解。

细菌学实验室负责人、助理教授Luciano Marraffini说：“像脊椎动物一样，微生物拥有能够适应新威胁的免疫系统。这些系统使用的一种酶Cas9，利用了免疫记忆来引导切割病毒遗传密码。然而，人们对于最初获得这些记忆的机制却知之甚少。我们的研究表明，Cas9还操控了某些细菌中这些记忆的形成。”

这些记忆嵌入在能够将有益和有害病毒识别开来，称作为CRISPR（规律成簇的间隔短回文重复）系统的细菌适应性免疫系统中。它通过改变细菌基因组，将一些称作为间隔序列（spacers）的短病毒序列添加到重复DNA序列之间来发挥作用。这些间隔序列形成了有关过去入侵物的一些记忆。它们充当CRISPR相关基因编码酶(Cas)的向导，使得Cas能够找到并破坏试图再次感染细菌的相同病毒。

Cas9能够在病毒或其他的基因组中实现精确切割这一能力引起了研究人员的注意。现在研究人员利用它来改变细胞的遗传学以达到某些实验或治疗目的，但对于这一CRISPR系统在天然细菌中发挥作用的机制仍不是很清楚（延伸阅读：Cell：用CRISPR构建衰老研究模型 ）。

一些证据表明，某些Cas酶（未包括Cas9）自身可以操控记忆形成过程。基于Cas9识别切割位点的方式，包括共同第一作者、研究生Robert Heler以及实验室博士后Poulami Samai在内的研究人员猜测Cas9在记忆形成中也发挥了作用。

除了匹配CRISPR引导序列和病毒DNA，Cas9需要在附近寻找第二信号：病毒DNA中的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motif，PAM)序列。这是一个至关重要的步骤，因为PAM序列的存在阻止了Cas9攻击细菌自身包含记忆的DNA。

Heler 说：“由于Cas9必须识别出PAM序列才会切割病毒DNA，在这一系统形成首次遭遇病毒的记忆时Cas9也就识别PAM序列对于我们来说很有意义。这是Cas9的一个意料之外的全新作用。”

为了检验他们的假说，Heler交换了化脓链球菌和嗜热链球菌免疫系统的Cas9酶，它们各自识别不同的PAM序列。结果，PAM序列跟随着在两种细菌之间发生了交换——表明在记忆形成中Cas9负责了PAM的识别。在另一个试验中，他改变了Cas9结合PAM序列的部分，发现这些微生物开始随机获得靶病毒序列,这使得它们变得不可用。

与此同时，Samai调查了Cas9与其他3种Cas酶：Cas1、Cas2和Csn2之间的关系。作为相同CRISPR系统的组件，研究人员怀疑这些酶在没有Cas9帮助的情况下在记忆形成中发挥了作用。

Samai让这些酶共同表达，随后标记每一个酶，并尝试提纯它。但每一次其他三种酶也一同出现。“这表明4种酶之间存在某种互作；最有可能的是它们在记忆获取过程中形成了复合物，”她说。

“由于Cas9具有靶向和切割病毒基因组的功能，它对生物技术非常重要，已吸引了人们极大的兴趣。我们的研究工作揭示出了Cas9一个遭到忽视的作用：形成了使得细菌适应性免疫成为可能的记忆，”Marraffini说。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Cas9 specifies functional viral targets during CRISPR–Cas adaptation

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) loci and their associated (Cas) proteins provide adaptive immunity against viral infection in prokaryotes. Upon infection, short phage sequences known as spacers integrate between CRISPR repeats and are transcribed into small RNA molecules that guide the Cas9 nuclease to the viral targets (protospacers). Streptococcus pyogenes Cas9 cleavage of the viral genome requires the presence of a 5′-NGG-3′ protospacer adjacent motif (PAM) sequence immediately downstream of the viral target. It is not known whether and how viral sequences flanked by the correct PAM are chosen as new spacers. Here we show that Cas9 selects functional spacers by recognizing their PAM during spacer acquisition. The replacement of cas9 with alleles that lack the PAM recognition motif or recognize an NGGNG PAM eliminated or changed PAM specificity during spacer acquisition, respectively. Cas9 associates with other proteins of the acquisition machinery (Cas1, Cas2 and Csn2), presumably to provide PAM-specificity to this process. These results establish a new function for Cas9 in the genesis of prokaryotic immunological memory.