Nature揭秘CRISPR系统的选择识别机制

　　像从单细胞到人类的所有免疫系统一样，细菌免疫系统面临的第一个挑战就是要检测出 “外源物质”与“自身物质”的差异。这并不简单，因为病毒、细菌和所有其他的生物都是由DNA和蛋白质构成。来自Weizmann研究所和以色列特拉维夫大学的一个研究小组，现在揭示出了细菌究竟是如何做到这一点的。

　　

生物通报道  细菌具有一种免疫系统来对抗称作为噬菌体的入侵病毒，也许会让你感到有些惊讶。并且像从单细胞到人类的所有免疫系统一样，细菌免疫系统面临的第一个挑战就是要检测出 “外源物质”与“自身物质”的差异。这并不简单，因为病毒、细菌和所有其他的生物都是由DNA和蛋白质构成。来自Weizmann研究所和以色列特拉维夫大学的一个研究小组，现在揭示出了细菌究竟是如何做到这一点的。他们的研究结果发表在4月13日的《自然》（Nature）杂志上。

Weizmann研究所分子遗传学系Rotem Sorek教授说：“在大多数环境中，噬菌体的丰度比细菌要高约10倍。并且像所有的病毒一样，细菌利用了宿主细胞的复制机器来生成自身拷贝。它们不断进化出一些新途径来做到这一点。因此细菌需要非常活跃的免疫系统维持存活。”

而直到近年，科学家们甚至都还不确定细菌具有一种适应性免疫系统——“记住”过去的遭遇来产生针对性的反应。当几年前一种叫做CRISPR的细菌适应性系统被发现，这种情况才发生改变。CRISPR免疫机制不仅对于细菌至关重要，对我们的日常生活也造成了重大的影响：例如，当前它被用来保护制造酸奶和奶酪的“好”细菌。它或许还会影响我们的未来：科学家们已经想到了如何利用这一精巧的CRISPR系统来“编辑”人类基因组——使得它成为了一种适用于广泛临床应用的简便工具（延伸阅读：Nature子刊：用CRISPR操控表观基因组 ）。

为了记住感染，CRISPR系统从入侵病毒DNA处抓取了一段短序列，将它直接插入到细菌基因组中。一些噬菌体DNA片段被储存在基因组的特定区域中；这些形成了免疫记忆。在随后的感染中，CRISPR利用这些序列构建出了与噬菌体遗传序列相匹配的短RNA链。连接这一RNA的蛋白质复合物随后鉴别出噬菌体DNA然后破坏它。

选择性很显然是这一系统的一个问题。在以往的研究中Sorek实验室证实，错误抓取自身DNA片段可导致细菌细胞罹患一种自身免疫疾病，攻击它自身的DNA，这对于细菌可能是致命的。Sorek说，在细胞内自身DNA比外源DNA要高约100倍，似乎为比研究人员实际观察到的要更多的错误提供了空间。

那么CRISPR系统是如何知道将外源DNA而非自身DNA片段插入到免疫记忆中去呢？Sorek和他的研究生Asaf Levy，与特拉维夫大学的Udi Qimron和Moran Goren教授合作详细解答了这一问题，揭示出了CRISPR这一部分过程背后一个复杂的、多步骤机制。

他们利用质粒——模拟病毒的短、圆形DNA片段，设计了一种实验装置并将其注入到细菌细胞中。这些细菌具有两种称作为Cas1和Cas2的蛋白——是CRISPR系统的组成部分，负责获取外源DNA片段。CRISPR系统成功地将质粒DNA整合到了细菌的基因组中，而“自身”DNA很少遭到攻击。研究小组记录了大约3800万个独立的免疫事件。

在更仔细地检测这些结果后，研究小组发现CRISPR系统利用Cas 1和2特异地识别了快速复制的DNA。而具有讽刺意味的是，这是噬菌体的一种生存策略，却也是造成它毁灭的原因。

Sorek说：“不过这仍然不能完全解释CRISPR系统是如何区分自我和非我的。”

更深入地了解整个过程让这一问题迎刃而解。在DNA复制过程中，频繁发生小的DNA断裂；这些断裂召唤了一种DNA修复酶“啃咬”断裂DNA片段。研究小组发现这一修复机器啃咬留下的一些“剩余物”，实际上是CRISPR利用来生成细菌免疫记忆的病毒DNA的来源。但是当这些修复酶遇到一种叫做“Chi位点”的短序列时，它会停止啃咬。这样的Chi序列非常频率地存在于整个细菌基因组中，但却很少存在于病毒基因组中。因此Chi位点也充当了“自我”标记物：当它们存在时会抵制CRISPR机器的活性，但如果缺失它们CRISPR机器就能够利用噬菌体DNA片段。

因此细菌细胞利用它的正常DNA复制和修复过程鉴别了噬菌体DNA，检测及复查了两种基本的方式都与“自身”基因组不同的新DNA。通过两个CRISPR蛋白Cas1和2的活性，细菌免疫系统可以确保它只将外源DNA添加到了免疫“记忆”中，因此可以激活它的防御。

Sorek说：“解开细菌免疫系统这个识别自我和非我的谜题，破译了CRISPR过程中这一步骤的确切机制为我们提供了关于这种环绕在我们周围，始终无处不在的、看不见的对抗的一些重要见解。在未来利用CRISPR系统的临床应用中或许可以利用细菌这种逃避自身免疫的方法。”

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

CRISPR adaptation biases explain preference for acquisition of foreign DNA

CRISPR–Cas (clustered, regularly interspaced short palindromic repeats coupled with CRISPR-associated proteins) is a bacterial immunity system that protects against invading phages or plasmids. In the process of CRISPR adaptation, short pieces of DNA (‘spacers’) are acquired from foreign elements and integrated into the CRISPR array. So far, it has remained a mystery how spacers are preferentially acquired from the foreign DNA while the self chromosome is avoided. Here we show that spacer acquisition is replication-dependent, and that DNA breaks formed at stalled replication forks promote spacer acquisition. Chromosomal hotspots of spacer acquisition were confined by Chi sites, which are sequence octamers highly enriched on the bacterial chromosome, suggesting that these sites limit spacer acquisition from self DNA. We further show that the avoidance of self is mediated by the RecBCD double-stranded DNA break repair complex. Our results suggest that, in Escherichia coli, acquisition of new spacers largely depends on RecBCD-mediated processing of double-stranded DNA breaks occurring primarily at replication forks, and that the preference for foreign DNA is achieved through the higher density of Chi sites on the self chromosome, in combination with the higher number of forks on the foreign DNA. This model explains the strong preference to acquire spacers both from high copy plasmids and from phages.