Nature Methods：利用CRISPR实现快速遗传筛查

　　近日，来自Fred Hutchinson癌症研究所的研究人员报告称，他们发现可通过改变Cas9和sgRNA浓度的方式来提高CRISPR的效率，并证实CRISPR可以作为一种强大的反向遗传筛查策略适用于脊椎动物系统。研究结果发布在4月13日的《自然方法》（Nature methods）杂志上。

　　

生物通报道  尽管已有传统的正向和反向遗传操作技术被用来鉴别维持生命必需的关键分子信号通路，通常评估的靶标数量有限，且非常的费时。诸如RNAi一类的反向遗传筛查技术虽然在无脊椎动物模型和细胞培养系统中显示出强大的效力，可用于快速鉴别与许多生物学过程相关的基因和信号通路，目前仍然缺乏适用于体内脊椎动物模型系统的高效、廉价的方法。

近日，来自Fred Hutchinson癌症研究所的研究人员报告称，他们发现可通过改变Cas9和sgRNA浓度的方式来提高CRISPR的效率，并证实CRISPR可以作为一种强大的反向遗传筛查策略适用于脊椎动物系统。研究结果发布在4月13日的《自然方法》（Nature methods）杂志上。

在过去的20年里，斑马鱼逐渐成为研究人类基因功能的重要脊椎动物模式生物。斑马鱼胚胎和幼鱼具有个体小，易于获取，胚胎透明的特点，可以在单细胞水平上进行大量活体检测分析，十分适用于基因功能研究。斑马鱼基因功能大部分是通过“正向遗传学”手段揭示的，首先在斑马鱼基因组中引入随机突变，在子代中鉴定表型的改变，但使用这种方法鉴定致畸突变工作量很大。

Agilent BioTek Synergy LX经济型多功能微孔板检测仪具有吸收光、荧光和发光检测模式，详细资料领取濠电姷顣藉Σ鍛村磻閸曨剚鍎熸繝濠傜墕缁狀垶鏌ㄩ悤鍌涘 闂傚倸鍊风粈渚€骞夐敓鐘冲仭闂侇剙绉寸粻顖炴煥閻曞倹瀚�

最初作为细菌和古细菌的一种适应性防御机制被发现的CRISPR，近年来作为一种强有力的基因编辑分子生物学工具，被广泛地应用于斑马鱼、人类、大鼠、小鼠、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造（延伸阅读：Nature揭秘CRISPR系统的选择识别机制 ）。CRISPR能够借助同源介导修复（HDR）或非同源末端连接(NHEJ)有效靶向基因组，导入一些改变来扰乱基因功能，由此认识感兴趣的基因对于生物过程所造成的影响。

只需要长度约为100个核苷酸一段向导RNA分子（sgRNA） ，以及一个能够切割DNA分子的Cas9核酸酶，II型CRISPR系统作为一种反向遗传工具尤其具有吸引力。在斑马鱼的单细胞期，将Cas9编码mRNA和sgRNA导入到胚胎中就可以诱导出可通过种系传递的突变。

在这篇Nature methods新文章中，研究人员称成功利用工程CRISPR有效地突变了斑马鱼中一些特定的位点，并筛查出了与一些脊椎动物生物过程相关的基因。他们证实通过注射优化数量的Cas9编码mRNA和多重sgRNAs可提高CRISPR的效率，使得能够在胚胎中模拟一些已知突变的表型。借助于48种sgRNA靶向与突触发生相关的潜在基因，他们鉴别出了两个与电突触形成相关的新基因。通过深度测序靶位点，研究人员证实90%的基因得到有效地筛查。

由此，研究人员提出CRISPR可作为一种强大的体内反向遗传筛查策略应用于脊椎动物系统。

（生物通：何嫱）

婵犲痉鏉库偓妤佹叏閻戣棄纾绘繛鎴欏灪閸婅埖绻濋棃娑卞剰缂佺姷鍠栭弻銊╂偆閸屾稑顏� 细胞能量代谢分析怎么做？安捷伦细胞分析学习中心和演示申请点这里！

生物通推荐原文摘要：

Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish

Identifying genes involved in biological processes is critical for understanding the molecular building blocks of life. We used engineered CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) to efficiently mutate specific loci in zebrafish (Danio rerio) and screen for genes involved in vertebrate biological processes. We found that increasing CRISPR efficiency by injecting optimized amounts of Cas9-encoding mRNA and multiplexing single guide RNAs (sgRNAs) allowed for phenocopy of known mutants across many phenotypes in embryos. We performed a proof-of-concept screen in which we used intersecting, multiplexed pool injections to examine 48 loci and identified two new genes involved in electrical-synapse formation. By deep sequencing target loci, we found that 90% of the genes were effectively screened. We conclude that CRISPR can be used as a powerful reverse genetic screening strategy in vivo in a vertebrate system.

 

闂傚倸鍊烽懗鍫曞箠閹剧粯鍊舵慨妯挎硾缁犳彃霉閿濆牊顏犻柣顓炵墦閺屻劑鎮ら崒娑橆伓

濠电姷鏁搁崑鐐哄垂閸洖绠伴柟闂寸贰閺佸嫰鏌涢锝囪穿鐟滅増甯掗悙濠囨煃鐟欏嫬鍔ゅù婊堢畺閺岋綁鎮㈤悡搴濆枈濠碘剝褰冨﹢閬嶅焵椤掑喚娼愰柟绋挎憸閳ь剚绋堥弲婵嬪焵椤掑嫭娑ч柕鍫熸倐瀵偊宕掗悙鏉戔偓閿嬨亜閹哄秶鍔嶉柣锕€閰ｅ铏规嫚閹绘帩鍔夌紓浣割儐鐢€崇暦濠靛绠虫俊銈傚亾缂佲偓婢舵劖鐓熼柡鍐ㄥ€哥敮鑸垫交濠靛洨绡€闁汇垽娼у瓭濠电偠灏欐繛鈧€规洘鍨块獮姗€骞囨担鐟板厞闁诲氦顫夊ú鏍洪妸鈺傚仼闁惧繐婀辩壕浠嬫煕鐏炲墽鎳呮い锔奸檮娣囧﹪顢曢敐鍥╃厜閻庤娲樺ú鐔笺€侀弮鍫濆窛妞ゆ牭绲剧粊顐︽⒒娴ｇ懓顕滅紒璇插€块幃褔骞樺鍕枔閳ь剨缍嗛崰妤呮偂濞嗘劗绠鹃柤濂割杺閸ゆ瑦顨ラ悙杈捐€块柡灞炬礋瀹曞爼濡搁妷銉︽嚈闁诲孩顔栭崳顕€宕滈悢鑲╁祦鐎广儱顦介弫濠囨煟閿濆懏婀版繛鍫熸倐濮婄粯鎷呴挊澶夋睏闂佺儵鍓濆Λ鍐ㄧ暦瑜版帗鎯炴い鎰剁稻閻濈兘姊虹粔鍡楀濞堟洘銇勯妷銉уⅵ闁哄本鐩獮姗€鎳犻澶嬓滃┑鐐差嚟婵參宕归崼鏇炶摕闁哄洢鍨归獮銏′繆閵堝拑宸ラ柛鎾讳憾閺岋綁濮€閳轰胶浠繝銏㈡嚀濡宓勯梺鍦濠㈡﹢锝為崨瀛樼厽婵炲棗鑻禍鎯р攽閻愯尙婀撮柛濠冩礋濠€渚€姊洪幐搴ｇ畵婵☆偅鐟х划鍫⑩偓锝庡枟閻撳啰鎲稿⿰鍫濈婵﹩鍘鹃埞宥夋煣韫囨凹娼愮€规洘鐓￠弻娑㈠箛閵婏附鐝栧銈傛櫇閸忔﹢寮婚妸銉㈡斀闁糕剝鐟ラ埅闈涒攽閳藉棗鐏犳い鎴濐樀瀵鈽夐姀鐘殿唺闂佺懓顕崕鎰涢敓鐘斥拺閻犲洤寮堕崬澶娾攽椤斿搫鈧鍒掑鑸电劶鐎广儱鎳愰ˇ銊ヮ渻閵堝棙灏靛┑顔惧厴椤㈡瑩骞掑Δ浣叉嫼闁荤姴娲犻埀顒冩珪閻忎線姊洪崨濠冪叆濡ょ姵鎮傞崺銏ゅ箻鐠囪尙顓洪梺鎸庢濡嫬鈻撻妷銉富闁靛牆妫涙晶顒傜磼椤旇偐鐒搁柛鈺傜洴瀵粙顢橀悢鍝勫箞婵犵數鍋涘Λ娆撳礉閺囥垺鍊堕柍鍝勫亞濞堜粙鏌ｉ幇顒€绾ч柛鐘筹耿閺岀喖顢涘姣櫻呪偓娈垮櫘閸ｏ絽鐣烽幒鎳虫梹鎷呯憴鍕絻

10x Genomics闂傚倸鍊风粈渚€骞栭锕€纾归柣鐔煎亰閻斿棙鎱ㄥ璇蹭壕濡ょ姷鍋為悧鐘诲灳閺傝￥鈧帗鍒婇悥鍓坢 HD 闂備浇顕х€涒晠顢欓弽顓炵獥闁圭儤顨呯壕濠氭煙閸撗呭笡闁绘挻娲橀幈銊ノ熼悡搴′粯闂佽绻掓慨鐑藉焵椤掑喚娼愭繛鍙夌矒瀹曚即骞橀懜娈挎綗闂佸湱鍎ら〃鍛寸嵁閵忊剝鍙忔慨妤€妫楁晶顔尖攽椤旂厧鏆ｆ慨濠冩そ瀹曘劍绻濋崒婊呮噯婵犵妲呴崑鍛垝瀹ュ桅闁哄啫鐗嗙粻鐟懊归敐鍥ㄥ殌濞寸姰鍨藉娲箹閻愭彃濮夐梺鍝勬噺缁捇骞冩ィ鍐╃劶鐎广儱妫涢崢閬嶆椤愩垺鎼愭い鎴濇噺閹便劑鍩€椤掆偓閳规垿鎮欑€涙ḿ绋囧┑鈽嗗亝缁挻淇婇悽绋跨疀闁哄鐏濆畵鍡涙⒑缂佹ǘ缂氶柡浣规倐閹剝鎷呴搹鍦紳婵炶揪绲介幉鈥筹耿閻楀牅绻嗛柣鎰煐椤ュ鎽堕悙鐑樼厱鐟滃酣銆冮崨顖滅焼闁糕剝绋掗悡鏇㈡煃閳轰礁鏆堢紓鍌涘哺閺屽秷顧侀柛蹇旂〒閸掓帒鈻庨幘铏€悗骞垮劚椤︿即寮查幖浣圭叆闁绘洖鍊圭€氾拷

婵犵數濮烽弫鎼佸磻濞戞娑欐償閵娿儱鐎梺鍏肩ゴ閺呮粌鐣烽弻銉﹀€甸柨婵嗛娴滅偤鏌嶇紒妯活棃闁诡喗顨婇弫鎰償閳ュ磭顔戠紓鍌欐閼宠泛鈻嶆晶淇皊t闂傚倸鍊风欢姘缚瑜嶈灋婵°倕鎳忛弲婵嬫煥濠靛棙宸濈紒鐘虫煥椤潡鎳滈棃娑橆潓濠碘槅鍋呰摫闁靛洤瀚伴獮妯兼崉鏉炴壆鎹曠紓鍌氬€哥粔宕囨濮樿泛钃熸繛鎴欏灩閸愨偓闂侀潧臎閸愶絾瀚涘┑鐘垫暩閸嬫盯鎮ф繝鍥у偍妞ゃ儳顎怱PR缂傚倸鍊搁崐鐑芥倿閿斿墽鐭欓柟鐑橆殕閸庡孩銇勯弽顐粶闁绘帒鐏氶妵鍕箳閸℃ぞ澹曟俊鐐€х紓姘跺础閹惰棄绠栫憸鏂跨暦椤愶箑唯闁靛牆妫楁刊浼存⒒娓氣偓閳ь剛鍋涢懟顖涙櫠閺夋垟鏀介柍銉﹀墯閸ょ喖鏌嶈閸撱劎绱為崱娑樼婵ǹ娉涘Ч鏌ユ煃閸濆嫭鍣洪柛濠傜仛缁绘盯骞嬮悙鍨櫑婵犳鍠栭崯鎾蓟濞戙垹绫嶉柟鐐綑椤忥拷

闂傚倸鍊风粈渚€骞夐敓鐘偓鍐幢濡炴洖鎼オ浼村川椤撶偟浜伴梻濠庡亜濞诧妇绮欓幒妤€鍚归柛鏇ㄥ灡閻撶喖鏌熼柇锕€澧婚柛銈囧枛閺屾洟宕奸悢绋垮攭濡ょ姷鍋為悧鐘差嚕閸洖绠ｉ柣妯活問閸炲爼姊绘担鍛婂暈闁荤喆鍎辫灋婵犻潧妫ḿ鏍р攽閻樺疇澹橀幆鐔兼⒑闂堟侗妾х紒鑼帶闇夐柣鎴ｅГ閻撶喖鏌ｅΟ澶稿惈闁告柨绉堕幉鎼佸级閸喗娈婚梺璇″枔閸庣敻寮幘缁樻櫢闁跨噦鎷� - 婵犵數濮烽弫鎼佸磿閹寸姴绶ら柦妯侯槺閺嗭附銇勯幒鎴濐仼闁活厽顨婇弻娑㈠焺閸愶紕绱板銈傛櫆閻擄繝寮诲☉銏犵労闁告劖鍎冲В鈧梻浣告贡閸庛倝骞愭ィ鍐︹偓鍛存倻閽樺顔愰柡澶婄墕婢х晫绮旈悽鍛婄厱閹兼番鍨归悘銉╂煃閽樺妯€妤犵偞锕㈤、娑橆潩椤愩埄妫滃┑鐘垫暩閸嬬偤宕归崼鏇炵闁冲搫鍊婚々鍙夌節婵犲倸鏆熼柡鍡畵閺岋綁寮崶顭戜哗缂佺偓鍎抽妶鎼佸蓟濞戙垹鐒洪柛鎰靛幖椤ユ繈姊洪崨濠冣拹閻㈩垽绻濋獮鍐ㄎ旈崨顓熷祶濡炪倖鎸鹃崑妯何ｉ幇鐗堚拺缂備焦岣块埊鏇㈡煟閻旀繂娲ょ粻顖炴倵閿濆骸鏋涚紒鐘崇叀閺岀喐瀵肩€涙ɑ閿梺璇″枙缁舵艾顫忓ú顏勫窛濠电姴鍊婚鍌涚節閳封偓閸曞灚鐤侀悗娈垮枟婵炲﹪骞冮姀銈嗗亗閹艰揪缍嗛崬瑙勪繆閻愵亜鈧牠寮婚妸鈺傚€舵繝闈涚墢閻滅粯绻涢幋娆忕仾闁绘挻鐟╅幃褰掑Ω閵夘喗笑闂佺ǹ锕ら…鐑藉箖閻戣棄顫呴柕鍫濇閸樺崬鈹戦悙鍙夘棡闁挎岸鏌ｈ箛瀣姕闁靛洤瀚伴、鏇㈠閳轰礁澹庨柣搴ゎ潐濞叉粍绻涢埀顒傗偓娈垮枙缁瑩銆侀弽顓ф晝闁挎繂鎳忕拠鐐烘倵濞堝灝鏋熼柟顔煎€垮顐﹀箻缂佹ɑ娅㈤梺璺ㄥ櫐閹凤拷

濠电姷鏁搁崑鐐哄垂閸洖绠伴柟闂寸贰閺佸嫰鏌涢锝囪穿鐟滅増甯掗悙濠冦亜閹哄棗浜鹃弶鈺傜箖缁绘繈鎮介棃娴躲垽鎮楀鐓庢珝闁诡垰鏈幆鏃堝Ω閿旀儳骞橀柣搴ゎ潐濞叉牕煤閵堝棛顩锋繝濠傜墛閻撴洟鏌ｉ幇顒傛憼閻忓骏绠撻弻鐔兼寠婢跺ň鍋撴繝姘劦妞ゆ帒锕︾粔鐢告煕閹炬潙鍝烘い銏℃婵¤埖寰勭€ｎ亙鍖栭梻浣筋潐婢瑰寮插☉娆庣箚闁惧繐婀辩壕濂告煏婵炑冨枤閺嗩參姊洪悷鏉挎Щ闁瑰啿閰ｉ妶顏呭閺夋垹顦ㄩ梺闈浤涢埀顒勫磻閹惧绡€婵﹩鍘鹃崢鎼佹煟鎼搭垳绉甸柛瀣閹便劑宕奸妷锔惧幐閻庡厜鍋撻柍褜鍓熷畷鐗堟償閵娿儳鍘洪梺鍝勫暙閻楀棝宕￠幎鑺ョ厽婵☆垱瀵ч悵顏呮叏閿濆懎顏柡宀嬬稻閹棃濮€閳垛晛顫岄梻浣告啞濮婂湱鏁垾宕囨殾婵犻潧顑嗛崑鍕煟閹惧啿顔傞柕澶嗘櫆閻撱儵鏌ｉ弴鐐测偓鍦偓姘炬嫹