新型CRISPR/Cas9打靶预测工具

　　最近，德国海德堡大学的科学家提出了一种CRISPR/Cas9打靶在线预测工具（CCTop, http://crispr.cos.uni-heidelberg.de），可克服现有工具所存在的局限性。相关研究结果发表在四月二十四日的国际著名学术期刊《PLOS ONE》。

　　

生物通报道：CRISPR/Cas9系统，为定向诱变和靶向基因组修饰提供了多种可能性。基因工程CRISPR-Cas核酸酶是由一种叫做Cas9的DNA切割酶，和一段与靶DNA片段匹配的20个核苷酸长度的短RNA片段所构成。它模拟了某些细菌的原始免疫系统。当这些微生物受到病毒或其他生物体的感染时，它们会拷贝入侵者的一段遗传密码，将它插入到自身的DNA中，并传递给细菌后代。如果在未来遇到相同的病原体，细菌的Cas9在与拷贝DNA片段匹配的RNA序列的引导下，通过在靶位点切割病原体的DNA而灭活它。

由于20个核苷酸长度的序列可以多次出现在一个给定的基因组中，CRISPR/Cas9复合体可能就会接受一些错配，因此，对靶位点进行高效而可靠的电脑模拟选择和评估，是实验成功的一个关键前提。为此，德国海德堡大学的科学家提出了一种CRISPR/Cas9打靶在线预测工具（CCTop, http://crispr.cos.uni-heidelberg.de），以克服现有工具所存在的局限性。相关研究结果发表在四月二十四日的国际著名学术期刊《PLOS ONE》。延伸阅读：刘小乐等：分析CRISPR/Cas9敲除的新算法。

随着工程核酸酶（如转录激活因子样效应器核酸酶TALEN）、锌指核酸酶（ZEN）或促进任何选择位点双链断裂（DSB）引入的RNA引导性核酸酶的出现，靶向基因组编辑技术已经可用于全部（模型）生物研究。

规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）/ CRISPR相关9（Cas9）系统，最初被发现是古细菌和细菌的“免疫反应”，已经迅速演变为一种选择工具。单导向RNA（sgRNA）可提供特异性并靶定Cas9内切酶，以将DSB引入sgRNA所确定的位点。靶序列的特点是：长二十个核苷酸，接着是一段原型间隔（protospacer）毗邻基序（PAM；在Cas9中是NRG）。有了这些简单的设计标准，我们就可以靶定一个特定基因组中的任何位点。然而，由于20个核苷酸长度的序列可以多次出现在一个给定的基因组中，CRISPR/Cas9复合体可能就会接受一些错配，因此，对靶向位点进行高效而可靠的电脑模拟选择和评估，是实验成功的一个关键前提。

为此，已经有许多在线查找和评价sgRNA打靶的工具，如CRISPR Design、E-CRISP或CHOPCHOP。对于打靶位点的选择，它们都有各自的长处和局限。特别是一些工具运行于限制性的参数集，在脱靶搜寻时考虑的不匹配太少，完全缺乏关于潜在脱靶位点的文档，或者只有一个有限的靶基因组列表。

为了给生物学家提供一种工具，以快速和有效地识别高质量的靶位点，该研究小组在新开发的CRISPR/Cas9打靶在线预测工具（CCTop）中结合优势并克服局限性。CCTop提供了一种直观的用户界面，有合理默认的参数，可以很容易地由用户调整。根据一段给定的输入序列，CCTop可以根据候选sgRNA靶位点的脱靶质量，识别并排列所有的候选sgRNA靶位点，并显示完整的文档。CCTop已经通过实验验证用于基因灭活、非同源末端连接以及同源指导修复。因此，CCTop为生物学家们提供了一种工具，可快速而有效地识别高质量的靶位点。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool
Abstract: Engineering of the CRISPR/Cas9 system has opened a plethora of new opportunities for site-directed mutagenesis and targeted genome modification. Fundamental to this is a stretch of twenty nucleotides at the 5’ end of a guide RNA that provides specificity to the bound Cas9 endonuclease. Since a sequence of twenty nucleotides can occur multiple times in a given genome and some mismatches seem to be accepted by the CRISPR/Cas9 complex, an efficient and reliable in silico selection and evaluation of the targeting site is key prerequisite for the experimental success. Here we present the CRISPR/Cas9 target online predictor (CCTop, http://crispr.cos.uni-heidelberg.de) to overcome limitations of already available tools. CCTop provides an intuitive user interface with reasonable default parameters that can easily be tuned by the user. From a given query sequence, CCTop identifies and ranks all candidate sgRNA target sites according to their off-target quality and displays full documentation. CCTop was experimentally validated for gene inactivation, non-homologous end-joining as well as homology directed repair. Thus, CCTop provides the bench biologist with a tool for the rapid and efficient identification of high quality target sites.