一步生成条件性基因敲除小鼠ESC

　　七月十四日，来自瑞士巴塞尔大学、Friedrich Miescher生物医学研究所的研究人员在Cell子刊《Cell Reports》发表一项研究成果。这项研究介绍了一种新的报告系统，可让我们一步实现高效的CKO mESCs体外生成，也能进行双等位基因的内源基因标记。

　　

生物通报道：最近发展的基因组编辑工具，包括转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和CRISPR/Cas9，使我们能够通过诱导双链断裂（DSBs）的非同源末端连接（NHEJ）修复，快速而有效的敲除靶向基因。然而，这种方法不能进行必需基因的功能研究，这类研究通常采用的策略是基于Cre-LoxP系统的条件性基因敲除（cKO）。

这就需要通过同源重组（HR）和诱导Cre重组酶表达，进行loxP位点的靶向整合（敲入）。Cre融合蛋白和人类雌激素受体ERT2的突变配体结合域，常用于4-羟基他莫昔芬（4OHT）对Cre重组酶活性的控制，4OHT可促进CreERT2从细胞质到细胞核的易位，在那里Cre可识别和重组嵌入基因组DNA的loxP位点。4OHT控制的基因敲除，不仅能让我们选择一个时间窗，在一个必需基因表现出其致命表型之前，研究它的功能，而且也能让我们评估一个基因缺失的直接影响。

产生诱导型CKO小鼠胚胎干细胞（mESCs）的传统方法是非常费时、费力的，需要产生和杂交携带靶向cKO（两端各放一个loxP序列）等位基因的小鼠。最近，在小鼠受精卵中Cas9刺激的、含loxP的单链寡脱氧核苷酸（ssODNs）的整合，可简化CKO mESC的生产，但仍然依靠使用活体动物。为了遵循减少使用实验动物的原则，简化并加快CKO MESC的生产过程，研究人员一直都在试图提高工程核酸酶介导的HR事件，这将允许直接向mESCs插入LoxP位点。

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七月十四日，来自瑞士巴塞尔大学、Friedrich Miescher生物医学研究所的研究人员在Cell子刊《Cell Reports》发表一项研究成果，题为“Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells”。这项研究介绍了一种新的报告系统，可让我们一步实现高效的CKO mESCs体外生成，也能进行双等位基因的内源基因标记。

在这项研究中，研究人员开发了体外产生无标记cKO mESCs和内源基因标记的试剂和流程。这种方法是基于重组报告质粒，它们赋予了EGFP荧光性或嘌呤霉素对工程核酸酶诱导的DSB修复的抗性。不同于先前公布的报告系统——依赖于容易出错的DSB NHEJ修复，这种新的报告系统，仅在HR修复后变得功能性，从而同时报告工程核酸酶的活性和HR通路的活性。

这种新方法首次使我们能够在一次转染步骤中，直接在mESCs的外显子双等位基因两侧各放一个LoxP位点。利用这种已确立的父母RosaC (Rosa26CreERT2/-)细胞系，任何配备基本细胞培养和分子生物学设备的实验室，可在不到3周的时间内，获得CKO mESCs。

与TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶通常所诱导的靶基因敲除相比，cKO策略使我们能够对必需基因进行功能缺失分析。它也排除了对观察到的基因敲除表型的误解，这些表型可能是由TALEN或Cas9基因组编辑相关的潜在脱靶效应引起的。这种选择程序的瞬态性质，可避免选择标记的基因组插入，使我们能够在同一细胞系中产生多个cKO等位基因。延伸阅读检测CRISPR/Cas9基因编辑系统的副作用。

最后，作者强调，虽然他们建立了与TALENs和mESCs相结合的重组报告系统，但它可能同样也与CRISPR/cas9系统强劲结合，并在多种细胞类型和生物体中使用。当基因组靶位点的序列特性不能使用一种可用的基因组编辑系统时，灵活地选择一种特殊的基因组编辑核酸酶，将是特别重要的。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Single-Step Generation of Conditional Knockout Mouse Embryonic Stem Cells
Summary: Induction of double-strand DNA breaks (DSBs) by engineered nucleases, such as CRISPR/Cas9 or transcription activator-like effector nucleases (TALENs), stimulates knockin of exogenous DNA fragments via homologous recombination (HR). However, the knockin efficiencies reported so far have not allowed more complex in vitro genome modifications such as, for instance, simultaneous integration of a DNA fragment at two distinct genomic sites. We developed a reporter system to enrich for cells with engineered nuclease-assisted HR events. Using this system in mouse embryonic stem cells (mESCs), we achieve single-step biallelic and seamless integration of two loxP sites for Cre recombinase-mediated inducible gene knockout, as well as biallelic endogenous gene tagging with high efficiency. Our approach reduces the time and resources required for conditional knockout mESC generation dramatically.