为CRISPR设计高效sgRNA的新方法

　　CRISPR-Cas9技术，为基因组工程提供了一个强大的系统。然而，不同单导向RNAs（sgRNAs）之间的可变活性，仍然是一个重要的限制。八月三十一日在Nature子刊《Nature Methods》发表的一项研究中，来自耶鲁大学医学院的研究人员，分析了影响体内sgRNA稳定性、活性和装载的分子特征。

　　

生物通报道：CRISPR-Cas9技术，为基因组工程提供了一个强大的系统。然而，不同单导向RNAs（sgRNAs）之间的可变活性，仍然是一个重要的限制。八月三十一日在Nature子刊《Nature Methods》发表的一项研究中，来自耶鲁大学医学院的研究人员，分析了影响体内sgRNA稳定性、活性和装载的分子特征。延伸阅读：基于PCR评估sgRNA特异性的方法。

基因组编辑系统，对于利用反向遗传学来理解基因功能，是必不可少的。锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）已被广泛用于产生短的插入或缺失（indel）突变。这些技术可使研究人员在多个生物系统中、通过蛋白质为基础的DNA识别，进行遗传工程，但是，它们受限于其可变的效率和繁琐的组装。最近，原核CRISPR-Cas9机制通过使用限制性内切酶Cas9和与靶DNA互补的sgRNA，可适用于真核细胞。它已成功地用于一些模式生物的诱导靶向基因突变，如线虫、果蝇诱导、小鼠和斑马鱼。然而，不同sgRNAs的可变活性，仍然会导致不一致的CRISPR-Cas9活性。确定体内sgRNA的稳定性、装载和打靶的分子特征，在很大程度上仍有待于探索。

最近，在人类和小鼠细胞系中开展的研究，已经鉴定了一些特征，可调节CRISPR-Cas9活活性，通过表型选择进行了评估。因此，外在特征（如微环境介导的双链断裂DNA修复和有害突变的选择）的影响，是很难与sgRNA固有特征的影响分开的。事实上，与高sgRNA活性相关的一个最强的特点是，sgRNA中的尿苷消耗，这实际上与用来表达sgRNAs的Pol III转录机制的终止信号相关。Gagnon和合作者绕过了这个问题，斑马鱼胚胎中靶定了100多个基因在，每一个都有一个单sgRNA。

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他们证实，毗邻protospacer相邻基序（PAM）的一个鸟嘌呤有助于分裂，这与在细胞系中开展的研究相一致，并指出了与靶向效率相关的其他特征序列。然而，目前尚不清楚的是，所检测的特定基因组位点对这些特征有多大的影响，因为每个基因只有一个sgRNA被评价。这可能会限制识别特定特征（介导sgRNA活性，如稳定性、Cas9装载和靶标识别）的能力。因此，利用CRISPR-Cas9系统在体内进行有效打靶的根本原理，尚不清楚。

在这项研究中，研究人员分析了1280个sgRNA（靶向128个基因）的稳定性、装载和致突变活性。他们发现，鸟嘌呤富集和腺嘌呤的消耗，可增加sgRNA的稳定性和活性，而特异的sgRNA装载、核小体定位和Cas9脱靶结合，并不是主要的决定因素。

研究人员还确定了被一个或两个核苷酸截短的sgRNAs，它们含有5′错配，被确定为典型sgRNAs的有效替代选择。在这项结果的基础之上，研究人员构建了一种预测性的sgRNA评分算法——CRISPRscan，可有效地捕捉到影响CRISPR-Cas9体内活性的序列特征。

最后，该研究小组发现，利用Cas9-nanos 3′ UTR将Cas靶定到生殖细胞，可产生母系合子突变体，也能提高存活率，并降低体细胞突变。总而言之，这些结构确定了影响Cas活性的决定因素，并为体内基因组打靶的高效sgRNA设计，提供了一个框架。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo
Abstract: CRISPR-Cas9 technology provides a powerful system for genome engineering. However, variable activity across different single guide RNAs (sgRNAs) remains a significant limitation. We analyzed the molecular features that influence sgRNA stability, activity and loading into Cas9 in vivo. We observed that guanine enrichment and adenine depletion increased sgRNA stability and activity, whereas differential sgRNA loading, nucleosome positioning and Cas9 off-target binding were not major determinants. We also identified sgRNAs truncated by one or two nucleotides and containing 5′ mismatches as efficient alternatives to canonical sgRNAs. On the basis of these results, we created a predictive sgRNA-scoring algorithm, CRISPRscan, that effectively captures the sequence features affecting the activity of CRISPR-Cas9 in vivo. Finally, we show that targeting Cas9 to the germ line using a Cas9-nanos 3′ UTR led to the generation of maternal-zygotic mutants, as well as increased viability and decreased somatic mutations. These results identify determinants that influence Cas9 activity and provide a framework for the design of highly efficient sgRNAs for genome targeting in vivo.