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著名华裔院士:CRISPR/Cas9介导的荧光原位杂交
【字体: 大 中 小 】 时间:2015年09月08日 来源:生物通
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近期,美国著名华裔生物化学家钱泽南院士参与的一项重要研究成果发表在《PNAS》,报道了一种新方法,使用体外构成的核酸酶缺乏的CRISPR/Cas9复合物作为探针,来标记序列特异性的基因组位点荧光素,而完全没有引起DNA变性,他们将这种方法称为Cas介导的荧光原位杂交(CASFISH)。
生物通报道:加州大学伯克利分校生物化学与分子生物学系钱泽南(Robert Tjian)教授是美国著名华裔生物化学家,其以研究真核生物细胞遗传信息转录闻名,担任国际顶级生物学期刊《Cell》杂志的编委,1991年当选美国国家科学院院士,2009年担任美国霍华德•休斯医学研究所(HIMI)主席。科学界将其与著名的华裔诺贝尔奖获得者钱永健以及美国华裔神经生物学家钱永佑并称为“加州钱氏三杰”。
近期,钱泽南院士参与的一项重要研究成果发表在《PNAS》,报道了一种新方法,使用体外构成的核酸酶缺乏的CRISPR/Cas9复合物作为探针,来标记序列特异性的基因组位点荧光素,而完全没有引起DNA变性,他们将这种方法称为Cas介导的荧光原位杂交(CASFISH)。本文通讯作者分别是HIMI的Wulan Deng和HIMI、艾伯特爱因斯坦医学院的Robert H. Singer。
在细胞中,基因组DNA是高度折叠的,并组织成三个维度。染色质在细胞核中的空间组织,以及不同染色质的相对位置,与正常发育和疾病中的基因调控是紧密相关的。DNA荧光原位杂交(FISH)已被广泛用于可视化序列特异性染色质结构域,或用于研究和诊断用途。尽管不断改进,但是DNA FISH仍需要热变性和甲酰胺处理,使dsDNA变性,以允许探针杂交,从而具有影响生物学结构完整性和基因组组构的风险。DNA FISH也因BAC探针的检测分辨率,以及寡核苷酸探针的高成本而受限。因此,这就为开发更简单、更高效、更强大的细胞DNA原位成像,提供了契机。
CRISPR-CRISPR相关的caspase 9(Cas9)系统,来源于化脓性链球菌,已成为靶向基因组编辑的一种革命性工具,其核酸酶缺陷的衍生物(dCas9)也被用来通过分别与转录调控域或荧光蛋白融合,控制活细胞中的基因表达,并可视化基因组位点。CRISPR系统提供的固有复用特性,对于高通量检测的用途,显示出很大的潜力。延伸阅读:为CRISPR设计高效sgRNA的新方法。
然而,扩大其在任何特定基因组位点空间动力学研究中的用途,仍然具有挑战性,因为这需要多色标签和几十到数百个单导向RNA(sgRNAs)的有效转导。CRISPR系统的体外研究表明,Cas9/sgRNA与其靶DNA有一种强大和稳定的亲和力。该研究小组假设,dCas9/sgRNA二元复合物可被改造为一种高度特异性和有效的酶探针,用于标记DNA,而完全不会引起DNA变性,而在DNA FISH程序中的热处理或化学处理都会引起DNA变性。
在这项研究中,研究人员报道了一种新的方法,使用体外构成的核酸酶缺乏的CRISPR/Cas9复合物作为探针,来标记序列特异性的基因组位点荧光素,而完全没有引发DNA变性作用,他们将这种方法称为Cas介导的荧光原位杂交(CASFISH)。
采用荧光标记的核酸酶缺陷的Cas9(dCas9)蛋白,其装配有各种单导向RNA(sgRNA),研究人员证明,他们能够在近着丝粒区、着丝粒、G富集端粒和编码基因位点,进行快速而强大的重复DNA元件的标记。
用大量sgRNA拼接的任意靶位点来组装dCas9,研究人员能够可视化不重复的基因组序列。dCas9/sgRNA二元复合物是稳定的,并以很高的亲和力与其靶DNA结合,从而允许多个靶标的顺序或同时探测。
CASFISH分析法使用不同颜色的dCas9/sgRNA复合物,可允许细胞内靶位点的多色标记。此外,CASFISH分析法在最佳条件下是非常快速的,适用于初生组织切片的检测。因此,这种快速、稳健、破坏性较少的技术,为基础研究和基因诊断,增加了一种非常有价值的工具。
(生物通:王英)
生物通推荐原文摘要:
CASFISH: CRISPR/Cas9-mediated in situ labeling of genomic loci in fixed cells
Abstract: Direct visualization of genomic loci in the 3D nucleus is important for understanding the spatial organization of the genome and its association with gene expression. Various DNA FISH methods have been developed in the past decades, all involving denaturing dsDNA and hybridizing fluorescent nucleic acid probes. Here we report a novel approach that uses in vitro constituted nuclease-deficient clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated caspase 9 (Cas9) complexes as probes to label sequence-specific genomic loci fluorescently without global DNA denaturation (Cas9-mediated fluorescence in situ hybridization, CASFISH). Using fluorescently labeled nuclease-deficient Cas9 (dCas9) protein assembled with various single-guide RNA (sgRNA), we demonstrated rapid and robust labeling of repetitive DNA elements in pericentromere, centromere, G-rich telomere, and coding gene loci. Assembling dCas9 with an array of sgRNAs tiling arbitrary target loci, we were able to visualize nonrepetitive genomic sequences. The dCas9/sgRNA binary complex is stable and binds its target DNA with high affinity, allowing sequential or simultaneous probing of multiple targets. CASFISH assays using differently colored dCas9/sgRNA complexes allow multicolor labeling of target loci in cells. In addition, the CASFISH assay is remarkably rapid under optimal conditions and is applicable for detection in primary tissue sections. This rapid, robust, less disruptive, and cost-effective technology adds a valuable tool for basic research and genetic diagnosis.
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