谁发明了基因编辑工具CRISPR-Cas9？

　　1月4日美国证券交易委员会（SEC）公布，CRISPR基因编辑公司Editas Medicine递交了在纳斯达克挂牌上市的申请文件，计划募集1亿美元。

　　

【新闻事件】：1月4日美国证券交易委员会（SEC）公布，CRISPR基因编辑公司Editas Medicine递交了在纳斯达克挂牌上市的申请文件，计划募集1亿美元。同一天人们也开始注意到，之前吵得沸沸扬扬关乎Editas命脉的CRISPR专利战又有了一些变化：美国专利与商标局（PTO）证实，责任审查员Michelle Joike建议由上诉委员会直接审核以加州大学伯克利分校Jennifer Doudna和她的同事作为申请人的CRISPR专利申请。这种叫做“Interference proceeding”（专利抵触程序）的罕见专利审核程序意味着加州贝克莱的专利审核不再是传统意义上的专利授权，而是同时挑战之前已经授权的相关专利。程序上也更象法庭设置，由专利申请人和被挑战的授权专利发明人在三位法官评判下“当面对质”，以便确认专利的最终授权，即挑战者可以接手已授权专利。这样又把谁是“自DNA双螺旋结构之后基因工程领域最大的科学发现”的发明人这一热门话题再次带入公众视野。

【药源解析】：CRISPR-Cas是在大多数细菌和古细菌中发现的一种天然免疫系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。当原核生物遇到外源的核酸比如病毒基因组或者质粒的时候，一些原核生物把一部分很短的外源序列整合到自己的一个或者多个CRISPR位点，接着CRISPR位点被转录生成CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA随后会引导DNA剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切未来入侵的外源核酸序列。所以俗称“魔术剪刀”的CRISPR-Cas9基因编辑技术是由一段介导RNA序列加上一个DNA水解酶Cas9组成，可以附着在基因组上几乎任何一个位置，并由Case9蛋白切开DNA序列的特定位点，然后在这个位点删除或添加特定的DNA片段（如图电影剪接）。所以CRISPR-Cas理论上不仅可以用作从基础研究到新药研发的工具，也可以修复变异的DNA因此作为药物治疗某些遗传疾病。除此之外CRISPR/Cas9使用简便、成本低廉，一些试剂公司比如Sigma/Aldrich已经开始接受不同CRISPR-Cas9的定制服务。《科学》杂志把CRISPR/Cas9基因编辑技术评为2015年最重要的“突破性发现”，更多科学家认为CRISPR/Cas9是自20世纪70年代生物技术时代以来出现的最重要的基因工程技术。
 
那么谁是最早发现、发明CRISPR/Cas9基因编辑技术的科学家呢？笔者以为应该至少从“CRISPR/Cas9的基础研究”，“CRISPR/Cas9在人类细胞中的具体应用”、和“CRISPR/Cas9基因编辑技术的法律发明人”三个方面讨论。
 
无容置疑，加州伯克利分校的结构生物学家Jennifer Doudna教授和德国亥姆霍兹医学研究中心的Emmanuelle Charpentier教授是最早报道把细菌天然免疫系统演变成CRISPR/Cas9基因编辑工具的科学家。2012年6月，Doudna/Charpentier联合课题组在《科学》杂志上发表CRISPR/Cas9作为基因编辑技术的第一篇研究论文，首次在体外证明CRISPR/Cas9技术可以切割任何的DNA链，指出CRISPR在活细胞中修改基因的能力，并且完整的讨论了CRISPR在基因组编辑上的可行性。正是Doudna和Charpentier的这些基础研究使CRISPR作为一种基因组编辑技术成为可能，也使生物学家认识到CRISPR/Cas9基因编辑技术的广阔应用前景。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因此也在2014年11月获得了由互联网巨头设立的奖金高达300万美元的生命科学突破奖（Breakthrough Prizes）。CRISPR被誉为本世纪到目前为止生物技术领域的最大突破。

在CRISPR/Cas9技术于人类细胞中的具体应用领域，2013年1月，哈佛大学的George Church实验室和麻省理工学院/哈佛大学的Broad研究所的张锋课题组在同一期的《科学》杂志上发表文章，证实了CRISPR/Cas9基因编辑技术被成功地运用到人类细胞的基因组，实现了CRISPR在哺乳动物细胞的基因编辑。几周后Jennifer Doudna也发表了她们自己实验室的类似结果。
 
在知识产权方面，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2012年5月25号申报了CRISPR/Cas9基因编辑技术的第一个专利申请（优先权日期2012年5月25号），包含了该项技术在不同种类细胞中应用的155项权利要求。但到目前为止她们的所有CRISPR/Cas9专利申请都没有获得授权。麻省理工/哈佛Broad研究所的张锋也自2012年12月12号开始申报了CRISPR-Cas9技术在真核生物上进行了基因组编辑的超过20项专利（第一个CRISPR-Cas9专利申请到优先权日期是2012年12月12号）。广泛涵盖了该项技术在真核细胞或者任何细胞有细胞核的物种中，以及针对不同适应症的各种应用。因为Broad研究所支付额外的费用，张峰的CRISPR/Cas9专利申请获得“快速通道”审核，PTO在2014年4月授予了张锋和Broad研究所首个CRISPR专利（专利号：US8697359）。到目前为止张峰的专利申请已经有14个获得授权，在欧洲也有4个已经被批准。
 
虽然Doudna/Charpentier联合课题组的专利申请早于张峰的CRISPR/Cas9专利申请，但因为直到2013年3月16日才实行新的“first to file规则”，而Doudna/Charpentier和张峰的专利申请都早于这个日期，美国专利授权仍按照较老版本的“first to invent规则”进行，即谁能够证明自己是第一个发明了CRISPR谁就获得专利，因此致使CRISPR/Cas9基因编辑技术的专利大战变得扑朔迷离。虽然Doudna和Charpentier于2012年5月就递交了专利申请，比张锋早7个月。但据说张锋提交了他的实验室笔记本后证实，他在2011年就开始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳动物细胞中的想法，并开始了CRISPR技术在人类细胞中的基因编辑，而且获得了第一个专利授权。当然，CRISPR/Cas9专利大战的胜负将取决于“CRISPR/Cas9基因编辑技术发明”的定义（是否在试管里进行基因编辑也算？，和这两个课题组谁能证明更早地成功地开展这些实验。如果Doudna/Charpentier的律师能使上诉委员会确信其《科学》文章发表后，CRISPR/Cas9基因编辑技术在细胞中如何使用变得显而易见（obviousness），Doudna/Charpentier也能赢得CRISPR/Cas9的最终专利授权。
 
从以上分析可看出，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、张峰、和George Church是相对独立地发明CRISPR/Cas9基因编辑技术的科学家，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技术的基础研究，而张峰和George Church在各种人类细胞中的应用方面贡献较多。至于CRISPR/Cas9技术的专利授权最终花落谁家，双方提供的证据说话。