简化人类细胞基因编辑的新方法

【字体: 时间:2016年01月20日 来源:生物通

编辑推荐:

  1月12日,来自美国威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员,在Cell子刊《Stem Cell Reports》发表的一项研究,提出了一个新的平台——ArrayEdit,可对CRISPR-Cas9基因编辑的人胚胎干细胞进行高内涵分析。

  

生物通报道:用RNA指导的CRISPR-Cas9系统的动物和植物基因组工程,正在改变着生物学。与其他基因工程工具相比,这种技术更容易使用,并且更有效,因此,在其发现后的短短几年内,就已经被广泛应用于世界各地的实验室,也成为编辑人类多能干细胞、人类胚胎干细胞基因组最常用的技术。1月6日,Cell子刊《Cell Stem Cell》在线发表了来自哈佛大学和麻省总医院研究人员的一篇综述文章。在这篇文章中,研究人员简单回顾了定制设计的核酸酶在hPSCs基因编辑中的应用,集中关注TALENs和CRISPR/Cas9的实际应用。突出了每种方法的优缺点,并讨论了实验设计的理论和技术方面的考虑。(Cell子刊综述:多能干细胞的基因组编辑

1月12日,来自美国威斯康星大学麦迪逊分校的研究人员,在Cell子刊《Stem Cell Reports》发表题为“High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells”的研究成果,该研究提出了一个新的平台——ArrayEdit,可对CRISPR-Cas9基因编辑的人胚胎干细胞进行高内涵分析。

CRISPR-Cas9这种新兴的基因组编辑工具,利用一种设计的核糖核蛋白复合物,由两个主要成分组成:(1)一个蛋白质,Cas9;和(2)一个引导性RNA(sgRNA)。同时,这种Cas9-sgRNA可切割基因组中的一段特定靶序列。CRISPR-Cas9编辑的人体细胞和组织,是药物靶标识别、管理科学、医学和基础生物学的重要资源。

然而,人类基因编辑实验通常需要为每个sgRNA进行费力的表达质粒克隆,在这些培养系统中,只有有限的机会观察和干扰起作用的基因组编辑,因为在DNA切割事件期间和之后不久,我们很难分离和影像活体的突变细胞。因此,有必要提高现有的体外人类细胞培养系统的通量和能力,在这些系统中,可以用人类细胞和组织评估新的基因组编辑方法。特别是用人类多能干细胞的先进功能,可能最终扩大人类的临床前模型系统,从患者特异性的细胞系,到从干细胞建立的复杂人类胚胎组织。

目前的基因组编辑技术,可产生异质性的人类细胞群,需要显著的后续表征。在继续其他研究之前,通过测序分析编辑细胞的基因组,是至关重要的,在测序分析过程中的几个流程,需要破坏突变的细胞群。例如,选择和新一代测序后的靶向基因破坏,可以鉴定药物靶标,DNA需要一个独立的、随后的基因编辑实验,来获得活的的突变细胞用于下游分析,这个过程对于缓慢分裂或原代细胞来说,往往是不可行的。这会降低适当编辑细胞的表观基因组和功能性特征。

目前,编辑的细胞内是否有持续的表观基因组和功能性问题,尚不明确。也需要在单克隆水平进行进一步的序列水平表征,因为有频繁和可变的中断,或供体基因插入到编辑细胞系中的非靶向等位基因中。最后,精确分离编辑细胞的效率,对现有方法来说仍然是一个挑战,通常只有20%或更低的效率,使人类基因组中产生近精确的缺失。

在这项研究中,研究人员描述了一个平台,称为ArrayEdit,将两种能力结合起来:一步法转录;将微触点印刷板和高内涵分析(HCA)相结合。首先,研究人员描述了一种方法,采用化学合成的寡核苷酸(以一种多孔道的方式有序排列),可以在几个小时并行产生许多sgRNAs。

一步法转录sgRNAs不用纯化就能传递,当与Cas9一起传递时,可以在人类胚胎干细胞(hESCs)中有效地产生所需的基因编辑。其次,研究人员描述了一种通用的培养和成像组合,通过对分布在编辑细胞集群的几千个空间定义特征进行非破坏性的分析,来选择编辑的细胞和组织。

研究人员能够在2周时间内,分离出基因编辑的胚胎干细胞系,其中82%是他们所期望的突变,位于概念证明位点(LAMA5),而没有任何可检测到的脱靶突变。该平台增加了重要的功能,可以让我们轻松地观察到人类细胞产生的复杂结构内的编辑和选择。

近期,相继有研究报道关于CRISPR-Cas9基因编辑技术的改进,例如,来自美国国立卫生研究院和瑞典乌普萨拉大学的研究人员,在国际著名学术期刊《Nucleic Acids Research》上发表的一项研究中,首次提出了一个已在斑马鱼中经过实验验证的CRISPR/Cas9靶序列数据库(首个CRISPR/Cas9靶序列数据库)。另外,来自中国科学院上海植物逆境生物学研究中心、昆士兰大学的研究人员报告称,他们构建出了一个新型的多路复用CRISPR/Cas9平台,可用于在拟南芥中快速及有效地编辑多个基因。这一重要的研究成果发布在12月的《Plant Cell Reports》杂志上(朱健康院士:开发新型多路复用CRISPR/Cas9平台)。我们有理由相信,随着科学家们进一步的努力,这种热门的CRISPR-Cas9基因编辑技术会更加趋向于完善。

(生物通:王英)

生物通推荐原文摘要:
High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells
Summary:CRISPR-Cas9 gene editing of human cells and tissues holds much promise to advance medicine and biology, but standard editing methods require weeks to months of reagent preparation and selection where much or all of the initial edited samples are destroyed during analysis. ArrayEdit, a simple approach utilizing surface-modified multiwell plates containing one-pot transcribed single-guide RNAs, separates thousands of edited cell populations for automated, live, high-content imaging and analysis. The approach lowers the time and cost of gene editing and produces edited human embryonic stem cells at high efficiencies. Edited genes can be expressed in both pluripotent stem cells and differentiated cells. This preclinical platform adds important capabilities to observe editing and selection in situ within complex structures generated by human cells, ultimately enabling optical and other molecular perturbations in the editing workflow that could refine the specificity and versatility of gene editing.

相关新闻
生物通微信公众号
微信
新浪微博
  • 搜索
  • 国际
  • 国内
  • 人物
  • 产业
  • 热点
  • 科普
  • 急聘职位
  • 高薪职位

知名企业招聘

热点排行

    今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

    版权所有 生物通

    Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

    联系信箱:

    粤ICP备09063491号