张昱研究员PNAS文章：利用CRISPR/Cas9解决遗传学难题

　　来自北京协和医学院、北京生命科学研究所（NIBS）的研究人员借助于CRISPR/Cas9系统证实了，在非经典末端连接中连接酶I（Ligase I）和连接酶III（ligase III）介导了DNA双链断裂连接。这项研究发布在1月19日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。

　　

生物通报道  来自北京协和医学院、北京生命科学研究所（NIBS）的研究人员借助于CRISPR/Cas9系统证实了，在非经典末端连接中连接酶I（Ligase I）和连接酶III（ligase III）介导了DNA双链断裂连接。这项研究发布在1月19日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。

论文的通讯作者是任职于北京协和医学院和北京生命科学研究所的张昱（Yu Zhang）研究员。张博士的主要兴趣是研究影响染色体转位发生的新因子，及研究癌症起始和发展中导致基因组不稳定的分子机制。

作为最重要的遗传物质，DNA持续发生不同程度的损伤。DNA修复不仅对维持正常细胞中的基因组稳定极为重要，也广泛地参与了癌变及进化。DNA双链双链断裂（DSB）是危害最大却普遍存在的DNA损伤形式，每个细胞每天大约经历10-100次DSB。DSB直接破坏染色体的物理连续性，若无法及时修复，可能因整段染色体的丢失而造成细胞衰老、凋亡或癌变。

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DSB主要通过两种途径进行修复：同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）。HR以完全相同的染色体作为模板执行精确的修复，但仅发生在DNA经历或完成复制的S期和G2期。NHEJ可在整个细胞周期发生，因为修复不需要模板，只基于断裂末端的结构而容易产生错误。哺乳动物细胞中的DSB主要通过NHEJ修复。

尽管在过去的20年里已对NHEJ信号通路的组成元件进行了广泛地研究，有研究观察到在各种情况下，缺失核心经典NHEJ因子如DNA连接酶IV(Lig4)的细胞中有着显著的DSB末端连接活动，表明存在非经典末端连接(A-EJ)活动。

在哺乳动物中已知的DNA连接酶只有Lig1、Lig3和Lig4。在这篇PNAS文章中，研究人员利用CRISPR/ Cas9系统构建出了小鼠CH12F3细胞系——在这些细胞中，除删除Lig4以外，细胞核中Lig1或Lig3被完全删除（这代表着细胞只包含一种DNA连接酶：Lig1或Lig3）。令人惊讶地是，研究人员发现包含Lig1和Lig3的复合物均可高效促进A-EJ介导的DSB修复，包括IgH位点的类别转换重组（CSB），CRISPR/Cas9在DSBs之间介导的染色体缺失。但在Lig4−/−细胞中只删除细胞核Lig3而不删除Lig1会显著减少染色体间转位，表明Lig3在催化染色体转位中发挥了独特的作用。对染色体转位连接处的微同源序列（microhomology）进行序列分析，揭示出了包含不同连接酶的复合物的特异性。这些数据表明在A-EJ中存在包含不同DNA连接酶的复合物。

CRISPR/Cas9系统是目前基因组编辑领域最受欢迎的新方法。CRISPR/Cas9来源于简单的细菌免疫系统,经过人为改造后,可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑。相比传统方法，CRISPR/Cas9提供具有许多的优势：设计简单、高效率和相对更低的成本花费。近两年，CRISPR/Cas9系统被广泛用于解决各种生物学基础问题。

近期，荷兰癌症研究所遗传学教授Reuven Agami与和同事们应用CRISPR搜寻了整个基因组中的调控增强子元件，阐明了p53和Erα两种蛋白的关键增强子序列（延伸阅读：Nature Biotechnology：利用CRISPR筛查人类基因组“垃圾”DNA ）。来自北京中医药大学、北京大学的研究人员报告称，她们采用CRISPR/CAS9介导基因组编辑miRNA-155，成功抑制了小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中的促炎性细胞因子生成（延伸阅读：北京中医药大学朱跃兰教授：用CRISPR介导基因组编辑miRNA ）。还有来自华东师范大学的研究人员报告称，他们采用Cas9蛋白来删除基因组大片段及敲入功能性基因盒（gene cassette），完成了对啮齿动物单细胞胚胎的基因组编辑（延伸阅读：华东师范大学用CRISPR编辑啮齿动物单细胞胚胎 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

Ligase I and ligase III mediate the DNA double-strand break ligation in alternative end-joining

In eukaryotes, DNA double-strand breaks (DSBs), one of the most harmful types of DNA damage, are repaired by homologous repair (HR) and nonhomologous end-joining (NHEJ). Surprisingly, in cells deficient for core classic NHEJ factors such as DNA ligase IV (Lig4), substantial end-joining activities have been observed in various situations, suggesting the existence of alternative end-joining (A-EJ) activities……

作者简介：

张昱 博士

北京生命科学研究所研究员

教育经历
2004瑞士弗雷德里克-米歇尔研究所博士
1999北京师范大学生物系硕士
1996北京师范大学生物系学士

工作经历
2013- 北京生命科学研究所研究员
2005-2012 哈佛大学医学院免疫疾病研究所博士后
2004-2005 瑞士弗雷德里克-米歇尔研究所博士后

研究概述
染色体的转位是许多血液癌症和实体瘤的特征。研究影响染色体转位发生的机理对研究癌症的起源及对其的预防和治疗提供了重要的启示。我们发现了DNA双链断裂的产生及基因组在细胞核中的空间排列对染色体转位的发生起着决定性的作用。 但是, 目前对于导致基因组DNA双链断裂的产生及后续形成染色体转位的其他因素的研究还不是很清楚。 同时, 这些可能因子在人类癌症中的作用也需要进一步的研究。 我们将要继续利用并完善已经建立的基因组高通量染色体转位测序方法来研究影响染色体转位发生的新因子. 同时我们也将使用其他多种手段, 并利用人类细胞和动物模型研究癌症起始和发展中导致基因组不稳定的分子机制。