上海交大教授Sci Rep：定量蛋白质组学技术揭示新分子机理

　　上海交通大学农业与生物学院的研究人员发表文章，通过定量蛋白质组学等多种实验方法，揭示了哈茨木霉菌纤维素酶与玉米根系互作系统诱导玉米抗叶斑病的分子机理。

　　生物通报道：上海交通大学农业与生物学院的研究人员发表了题为“Cellulase from Trichoderma harzianuminteracts with roots and triggers induced systemic resistance to foliar disease in maize”的文章，通过定量蛋白质组学等多种实验方法，揭示了哈茨木霉菌纤维素酶与玉米根系互作系统诱导玉米抗叶斑病的分子机理。

这一研究成果公布在11月10日的Scientific Reports杂志上，文章的通讯作者为上海交通大学农业与生物学院陈捷教授，陈教授主要从事蛋白质组学与分子病理学、环境微生物与生物农药基因工程，以及植物病虫害综合防治等方面的研究。

木霉菌是自然界广泛分布的真菌，国际公认的生物防治真菌，以往主要用于生物防治土壤传播的病害。近年来随着以病原菌相关分子模式/微生物相关分子模式（PAMP/MAPM）为核心的植物基础免疫学理论的提出和组学技术广泛应用，使得人们对木霉菌生物防治植物病害机理的研究上升到一个新的阶段，尤其木霉菌诱导植物抗性分子机理研究已成为生物防治基础研究的热点。

在这篇文章中，研究人员从植物—病原菌-生防木霉菌三方分子互作角度，揭示了哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）在定殖玉米种子或根系过程中，通过锌指转录因子（Thc6）与木霉菌两种纤维酶基因(Thph1,exo-1,4-β-D-–glucanase; Thph2，endo-1,4-β-D-glucanase）启动子区GGCTAA和GGCTAAA结合，调控两纤维素酶基因表达。

研究表明，木霉菌分泌的两纤维素酶基因能促进木霉菌玉米根系皮层内定殖，并发现木霉菌能在根皮层细胞内分泌Thph1、Thph2蛋白。研究人员分别用野生株、Thc6、两纤维素酶基因敲除子和Thph1、Thph2蛋白处理玉米根部组织，证明纤维素酶是木霉菌系统玉米抗病性的重要激发子（elicitor），能够激发叶片JA/ET信号(Opr7, Pr4, Erf1, Aoc1）上调表达和活性氧的积累。

此外，研究人员还通过HPLC检测到木霉菌处理的玉米根部组织释放出纤维素降解产物纤维二糖，并证明纤维二糖也参与玉米防御相关基因Opr7、Erf1的上调表达和抗病性诱导。定量蛋白质组学分析也发现，Thph1基因敲除后，导致玉米叶片防御反应JA/ET通路相关蛋白MYC2、ACO表达下调，活性氧清除相关蛋白POD表达明显下调，进一步说明该基因与诱导抗性正相关。

这项研究提出了哈茨木霉系统诱导植物抗叶斑病防御反应的作用模式：哈茨木霉菌在锌指转录因子Thc6调控下，在玉米根皮层内分泌两个胞外纤维素水解酶，即MAMPs(微生物相关分子模式)分子，MAPMs与玉米根细胞互作降解其细胞壁纤维素分子，释放纤维二糖，即DAMPs（损伤相关分子模式）等糖类小分子。纤维素酶和纤维二糖与根皮层细胞互作诱导玉米根部防御反应，并通过JA/ET信号长距离转导，从而激发玉米叶片对叶斑病的抗性。

关于植物病虫害综合防治方面的研究，近年来不少科学家利用新型技术CRISPR进行分析，如来自西南大学、中科院西北高原生物研究所的科学家通过CRISPR/Cas系统实现林木植物毛白杨（Populus tomentosa Carr.）的基因组编辑和靶基因突变。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统，在毛白杨中实现了基因组编辑和靶基因突变。研究人员设计了四个引导RNA（gRNA），来靶定毛白杨八氢番茄红素脱氢酶基因8 (PtoPDS)的不同基因组位点。在农杆菌介导的转化之后，研究人员在转基因杨树中观察到了明显的白化表型。通过分析RNA引导的基因组编辑事件，59个PCR克隆中有30个是纯合子突变体，有2个是杂合子突变体，这些目标位点的突变效率估计是51.7%。这些数据表明，我们可以利用Cas9/sgRNA系统，在木本植物中精确地编辑基因组序列，并有效地建立基因敲除突变体。我科学家用CRISPR实现杨树定向诱变

作者简介：

陈捷教授
1959年11月出生，九三学社社员。1983年毕业于沈阳农业大学，获农学学士学位；1986年毕业于沈阳农业大学，获农学硕士学位；1991年毕业于沈阳农业大学，获农学博士学位；1996-1997年韩国庆北大学博士后；2002-2003年美国康奈尔大学高级访问学者；先后6次赴美国、以色列、韩国短期学术交流和培训；现任上海交通大学农业与生物学院副院长，崇明生态农业中心副主任，教授、博士生导师，享受国务院特殊津贴，中国植物保护学会常务理事，中国生物防治专业委员会副主任。
研究方向： （1）蛋白质组学与分子病理学；（2）环境微生物与生物农药基因工程；（3）植物病虫害综合防治

原文摘要：

Cellulase from Trichoderma harzianuminteracts with roots and triggers induced systemic resistance to foliar disease in maize

Trichoderma harzianum is well known to exhibit induced systemic resistance (ISR) to Curvularia leaf spot. We previously reported that a C6 zinc finger protein (Thc6) is responsible for a major contribution to the ISR to the leaf disease, but the types of effectors and the signals mediated by Thc6 from Trichoderma are unclear. In this work, we demonstrated that two hydrolases, Thph1 and Thph2, from T. harzianumwere regulated by Thc6. Furthermore, an electrophoretic mobility shift assay (EMSA) study revealed that Thc6 regulated mRNA expression by binding to GGCTAA and GGCTAAA in the promoters of the Thph1 andThph2 genes, respectively. Moreover, the Thph1 and Thph2 proteins triggered the transient production of reactive oxygen species (ROS) and elevated the free cytosolic calcium levels in maize leaf. Furthermore, the genes related to the jasmonate/ethylene signaling pathway were up-regulated in the wild-type maize strain. However, the ΔThph1- or ΔThph2-deletion mutants could not activate the immune defense-related genes in maize to protect against leaf disease. Therefore, we conclude that functional Thph1 and Thph2 may be required in T. harzianum to activate ISR in maize.