科学家开发新的CRISPR系统——可调、可逆的一步式基因表达控制

【字体: 时间:2016年12月23日 来源:生物通

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  12月20日,在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中,来自加州大学圣地亚哥分校的研究人员,报道了一种可调的CRISPR-cas系统——tCRISPRi,用于基因表达的精确和连续的滴定测量。

  

生物通报道:控制基因表达水平的能力,是生物学中的一个主要任务。一种广泛使用的方法是删除一个感兴趣的非必须基因(Knockout),或者多步重组让一个感兴趣的基因表达减少(Knockdown)。然而,这些遗传学方法是费时费力的,并且对于定量研究来说是有限的。12月20日,在Nature子刊《Scientific Reports》发表的一项研究中,来自加州大学圣地亚哥分校的研究人员,报道了一种可调的CRISPR-cas系统——tCRISPRi,用于基因表达的精确和连续的滴定测量。延伸阅读:Science采用改进CRISPR技术 发现近500个新的lncRNAsPNAS:科学家制备双重核酸酶让CRISPR技术更上一层楼张锋发表CRISPR新突破 实现简单的多重基因编辑

CRISPR-Cas是原核生物中RNA介导的一种免疫系统,它是由CRISPR和CRISPR相关蛋白Cas组成的。根据它们的进化关系主要有三种类型的CRISPR-Cas系统。在化脓性链球菌II型CRISPR-Cas系统中,大的单蛋白Cas9 具有RuvC样和HNH核酸内切酶结构域,负责靶DNA的切割以引起双链断裂。在HNH和RuvC样核酸酶结构域具有突变的核酸酶缺陷型Cas9(dcas9),不能切割DNA。相反,dCas9可紧密结合靶DNA,从而影响转录。dcas9可以瞬时或稳定地控制基因表达的水平,而不改变基因序列本身。最近开发的一种合成系统,可在体内减少RNA的加工步骤。Cas9的这些特性使其成为CRISPR介导的干扰 (CRISPRi) 的一种有力的工具。

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同时,CRISPR Cas9用于基因组DNA编辑和基因调控的精度和通用性是强大的,许多CRISPR Cas9系统被Cas9的组成型表达引起的毒性所阻碍。原则上,这个问题可以通过在一个理想的可诱导和可调节的启动子下表达Cas9而得以解决。这将允许我们以一种剂量依赖性的模式,对Cas9的表达水平进行精确调控。不幸的是,许多常用的细菌诱导型启动子所起的作用是“开/关”开关,并缺乏一个变阻器样的功能来允许这种可调的基因表达。最近,有研究人员在一个木糖诱导型启动子下表达了dcas9,来敲除枯草芽孢杆菌中的必需基因,并基于功能分析表征了必需基因的网络结构。

将CRISPR -(d)Cas9系统用于高通量实验的另一个实际问题是,构建sgRNA用于靶定新基因的过程是费时费力的。目前用于sgRNA构建的方法主要依靠基于质粒的分子克隆技术,其次是转化。然而,质粒通常存在于多个副本中,因此当需要精确量化时它们就不太理想。质粒也含有自己的基因,并需要通过药物选择得以维持。因此,多拷贝质粒为基础的系统可能会抑制一般细胞的生长和基因表达,并且对细胞生理产生显著影响。

在这项研究中,研究人员开发了一种可调的CRISPRi (“tCRISPRi”),它可以对大多数的必需和非必需基因实现30倍的抑制。研究人员还设计了细菌基因组,这样PBAD启动子就能够以一种剂量依赖性系统被阿拉伯糖诱导,而在缺乏阿拉伯糖的情况下没有表现出最小泄漏的双峰表达。根据外部添加的阿拉伯糖,dCas9的表达是以一种线性的方式进行回应。重要的是,这个品系只需要一个单链寡核苷酸重组步骤,就可以将想得到的sgRNA插入到染色体,以允许它的组成型表达。

这些结果表明,tCRISPRi与重组相结合,为基因表达的控制提供了一种简单和易于操作的工具,并且非常适合于单个sgRNA和高通量可调的knockdown文库的构建。

(生物通:王英)

生物通推荐原文摘要:
tCRISPRi: tunable and reversible, one-step control of gene expression
Abstract:The ability to control the level of gene expression is a major quest in biology. A widely used approach employs deletion of a nonessential gene of interest (knockout), or multi-step recombineering to move a gene of interest under a repressible promoter (knockdown). However, these genetic methods are laborious, and limited for quantitative study. Here, we report a tunable CRISPR-cas system, “tCRISPRi”, for precise and continuous titration of gene expression by more than 30-fold. Our tCRISPRi system employs various previous advancements into a single strain: (1) We constructed a new strain containing a tunable arabinose operon promoter PBAD to quantitatively control the expression of CRISPR-(d)Cas protein over two orders of magnitude in a plasmid-free system. (2) tCRISPRi is reversible, and gene expression is repressed under knockdown conditions. (3) tCRISPRi shows significantly less than 10% leaky expression. (4) Most important from a practical perspective, construction of tCRISPRi to target a new gene requires only one-step of oligo recombineering. Our results show that tCRISPRi, in combination with recombineering, provides a simple and easy-to-implement tool for gene expression control, and is ideally suited for construction of both individual strains and high-throughput tunable knockdown libraries.

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