Cell子刊：简单CRISPR-Cas9敲除技术

　　加州大学洛杉矶分校的Courtney S. Young是一名“预备级”博士后，同时也是加州大学杜氏肌营养不良Bruin联盟主席。Young的堂弟患上了这种令人痛苦的罕见病，从那以后Young就决定要将其毕生精力投入到杜氏肌营养不良症的治疗方法中去。

　　

生物通报道：加州大学洛杉矶分校的Courtney S. Young是一名“预备级”博士后，同时也是加州大学杜氏肌营养不良Bruin联盟主席。Young的堂弟患上了这种令人痛苦的罕见病，从那以后Young就决定要将其毕生精力投入到杜氏肌营养不良症的治疗方法中去。

近期Young的研究组发表了题为“A Single CRISPR-Cas9 Deletion Strategy that Targets the Majority of DMD Patients Restores Dystrophin Function in hiPSC-Derived Muscle Cells”的研究论文，研发出了一种能最终治愈杜氏肌营养不良症的新技术，这种干细胞基因疗法适用于60%的杜氏肌营养不良症患者。研究成果公布在Cell Stem Cell杂志上。

文章的第一作者就是Courtney S. Young，Young说，这项研究主要利用了改进型CRISPR/Cas9 技术，可以纠正引发杜氏肌营养不良症的遗传突变。

在5000个男性新生儿中，杜氏肌营养不良症就影响着1位婴儿的健康，大多数的患者在10岁之前就会坐上轮椅，而且存活时间不超过20年，有些患者或许可以生存到30出头。

这种疾病通常是由于dystrophin基因的一个突变引起的，正常人体内，dystrophin蛋白能帮助加强和联接肌肉纤维与细胞，因此上百个突变就会导致肌肉出现萎缩，但是60%杜氏肌营养不良症患者体内 的突变都是出现在这一基因的一个特殊热点上。

为此加州大学洛杉矶分校的研究人员开发了聚焦于这一热点的平台，他们首先从杜氏肌营养不良中心患者获取了皮肤细胞，这些患者的突变都出现在dystrophin基因热点。然后研究人员将这些细胞重编程，在FDA标准化研究中心中创建出了诱导多能干细胞，这种标准化中心是未来实现人体临床实验的重要一步。

接下来，研究人员利用新CRISPR/Cas9 技术在iPS细胞中敲除了突变，从而靶向移除了dystrophin基因的特殊特点区域，逆转了蛋白。

研究组成员将iPS细胞分化成心肌和骨骼肌细胞，然后将这些细胞移植到携带dystrophin突变基因的小鼠中，结果发现移植后小鼠能成功的生成人类dystrophin蛋白。

此前京都大学iPS细胞研究和应用中心的研究人员也利用诱导多能干(iPS)细胞来纠正导致杜氏肌营养不良（DMD）的基因突变（Cell子刊：用CRISPR、TALEN技术实现iPS细胞治疗）。但这项研究是迄今为止利用CRISPR/Cas9在dystrophin基因中实现的最大敲除，也是首次成功纠正人体iPS细胞，直接逆转受到杜氏肌营养不良影响的功能性肌肉组织（之前科学家也曾利用 CRISPR/Cas9 修复了更少数目杜氏肌营养不良人群，并且细胞类型也并没有存在必需临床相关性）。

作者表示，“这项工作表明利用一种简单的基因编辑平台，加上细胞的再生能力，就能纠正基因突变，逆转60%的杜氏肌营养不良患者体内的dystrophin表达。“

（生物通：万纹）

原文摘要：

A Single CRISPR-Cas9 Deletion Strategy that Targets the Majority of DMD Patients Restores Dystrophin Function in hiPSC-Derived Muscle Cells

Mutations in DMD disrupt the reading frame, prevent dystrophin translation, and cause Duchenne muscular dystrophy (DMD). Here we describe a CRISPR/Cas9 platform applicable to 60% of DMD patient mutations. We applied the platform to DMD-derived hiPSCs where successful deletion and non-homologous end joining of up to 725 kb reframed the DMD gene. This is the largest CRISPR/Cas9-mediated deletion shown to date in DMD. Use of hiPSCs allowed evaluation of dystrophin in disease-relevant cell types. Cardiomyocytes and skeletal muscle myotubes derived from reframed hiPSC clonal lines had restored dystrophin protein. The internally deleted dystrophin was functional as demonstrated by improved membrane integrity and restoration of the dystrophin glycoprotein complex in vitro and in vivo. Furthermore, miR31 was reduced upon reframing, similar to observations in Becker muscular dystrophy. This work demonstrates the feasibility of using a single CRISPR pair to correct the reading frame for the majority of DMD patients.