上海海洋大学国家项目CRISPR研究成果

　　3月23日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线发表了上海海洋大学、密歇根州立大学的一项学术成果。这项研究报道了为七鳃鳗基因组而优化的一个CRISPR/Cas系统，并用它来破坏东北七鳃鳗（Lethenteron morii）的基因组位点，效率在84~99%之间不等。

　　

生物通报道：七鳃鳗（Lampreys）是无颌类动物的现存代表。对于七鳃鳗发育学、生理学和基因组学的描述，为脊椎动物的早期进化，提供了重要见解。然而，目前一直没有开发出一种有效的方法，在无颌纲动物中进行遗传操纵，从而阻碍了对这些重要演化发育生物学模型的基因进行功能性研究。

3月23日，Nature旗下子刊《Scientific Reports》在线发表了上海海洋大学、密歇根州立大学的一项学术成果，题为“Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system”。这项研究报道了为七鳃鳗基因组而优化的一个CRISPR/Cas系统，并用它来破坏东北七鳃鳗（Lethenteron morii）的基因组位点，效率在84~99%之间不等。

本文通讯作者是国家“****”特聘教授李伟明博士。李教授现任美国密歇根州立大学终身教授、终身讲席教授（Chair Professor）。他的主要研究领域为环境生物学、外激素通信、脊椎动物内分泌学和基因组学的研究，并已在这几个领域里取得了杰出的成就，备受瞩目。年来，李伟明教授科研成果丰硕，在《SCIENCE》、《PNAS》、《JOURNAL OF NEUROSCIENCE》）、《BMC Evolutionary Biology》等国际顶级学术期刊发表多篇具有很强学术影响力的论文。 

七鳃鳗和八目鳗类鱼是无颌脊椎动物的唯一幸存谱系。作为有颌类的外类群，无颌类动物的发展和演化已经得以广泛研究。这些研究对于脊椎动物的起源和早期演化，提供了重要的见解。特别是，七鳃鳗的研究有助于揭示脊椎动物的可能发展机制，以及脊椎动物独有特征的起源，如神经嵴、真正的大脑、咽骨架、下巴、脊椎和附器。此外，七鳃鳗已经被广泛作为生物医学模型，用以阐明适应性免疫、脊髓再生、运动和神经元变性的调控机制。

除了少数例外，如通过吗啉代敲除和RNA干扰技术阐明特定基因的功能，七鳃鳗发育和基因功能的研究，主要都是描述性的。为了定义一个物种中必需基因的功能，基因组数据和一种编辑基因组的手段，都是不可或缺的。目前，有两个七鳃鳗物种——八目鳗(Petromyzon绿)和日本七鳃鳗(Lethenteron日本血吸虫)的基因组草图，已经是可用的。然而，用于七鳃鳗物种基因诱变的技术尚未建立。建立一种技术，通过种系传递产生突变，在七鳃鳗物种中是难以实现的，因为这个物种经过了漫长 (20年才能达到性成熟)而复杂的生命周期。

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因此，目前还没有相关研究报道过养殖七鳃鳗（或任何无颌纲动物）的一个完整生命周期。此外，七鳃鳗是终生一胎的物种；性发育成熟的成年七鳃鳗产卵一次，从而使研究人员极难获得足够的F1和F2个体，即便是可以养殖七鳃鳗至成熟。这项研究推断，七鳃鳗物种基因功能的研究，需要有一种方法，能够有效地破坏建立者（F0代）基因组位点的两个等位基因。此外，许多物种具有解决某些生物学问题的独特优势，但是通过种系传递方法不易于操纵，当在F0代进行基因组编辑变得可行时，它们也应该成为更有用的模型系统。

最近，科学家们开发出一系列的设计者核酸酶，可靶定特定的内生DNA序列。在这些系统当中，CRISPR/Cas系统已经成为一种首选方法，因为它将靶基因突变引入各种模式生物的简单性和高效率。此外，具有高裂解活性的CRISPR/Cas9系统，已被证明可在胚胎干细胞以及生物（包括小鼠、猪和斑马鱼）中有效地切割一个靶基因的两个等位基因。

在这项研究中，研究人员报道了为七鳃鳗基因组而优化的一个CRISPR/Cas系统，并用它来破坏东北七鳃鳗的基因组位点，效率在84%到99%之间。根据七鳃鳗幼体基因组DNA样本的直接测序得出，在golden (gol)、kctd10、wee1、soxe2和wnt7b的靶位点中观察到的插入缺失频率，分别是68/69、47/56、38/39、36/37核36/42。这些插入缺失往往发生在两个等位基因中。在对gol或kctd10进行CRISPR/Cas9处理后，38.6%或85.3%的目标幼虫有各自的隐性无效样表型，从而进一步验证了两个等位基因的破坏。

kctd10 gRNA——被设计针对Kctd10的一个基本功能区域，可导致无效样表型和等位基因中的框内突变。研究人员得出结论：CRISPR/Cas9技术是一种有效的手段，可破坏七鳃鳗内源性基因的两个等位基因。

此前，国内外就有学者将CRISPR基因编辑系统应用于鱼类研究。去年11月，来自西南大学、日本爱媛大学和美国马里兰大学研究人员，在国际著名遗传学期刊《PLOS Genetics》发表一项学术研究成果。这些研究结果强调了TGF-β信号通路在鱼性别决定中的保守作用（西南大学将CRISPR用于鱼类遗传学研究）。随后的12月，意大利多恩动物研究所的研究人员，提出了一种快速的、便宜的CRISPR/Cas9斑马鱼突变体筛选方法，有潜力应用于斑马鱼以及适合于基因组编辑的每种动物模型的高通量筛选。相关研究结果发表在12月16日的《Molecular Biotechnology》（快速便宜的CRISPR/Cas9突变体筛选方法）。今年3月份，苏州大学基础医学与生物科学学院王晗课题组，在国际著名学术期刊《Scientific Reports》发表一项最新研究成果。这项研究证明，TALEN和CRISPR-Cas9都是修改普通鲤鱼基因组的高度有效的工具，并为促进鲤鱼遗传学研究和育种，开辟了新的途径（苏州大学973首席科学家CRISPR研究成果）。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system
Abstract: Lampreys are extant representatives of agnathans. Descriptions of lamprey development, physiology and genome have provided critical insights into early evolution of vertebrate traits. However, efficient means for genetic manipulation in agnathan species have not been developed, hindering functional studies of genes in these important Evo-Devo models. Here, we report a CRISPR/Cas system optimized for lamprey genomes and use it to disrupt genomic loci in the Northeast Chinese lamprey (Lethenteron morii) with efficiencies ranging between 84~99%. The frequencies of indels observed in the target loci of golden (gol), kctd10, wee1, soxe2, and wnt7b, estimated from direct sequencing of genomic DNA samples of injected lamprey larvae, were 68/69, 47/56, 38/39, 36/37 and 36/42, respectively. These indels often occurred in both alleles. In the CRISPR/Cas9 treatment for gol or kctd10, 38.6% or 85.3% of the targeted larvae had the respective recessive null-like phenotypes, further confirming the disruption of both loci. The kctd10 gRNA, designed against an essential functional region of Kctd10, resulted in null-like phenotypes and in-frame mutations in alleles. We suggest that the CRISPR/Cas-based approach has the potential for efficient genetic perturbation in organisms less amenable to germ line transmission based approaches.