Nature子刊：液体活检技术的新进步

　　循环肿瘤DNA（ctDNA）的高通量测序有望实现个性化的癌症治疗。不过，血液中的游离DNA（cfDNA）有限，限制了分析灵敏度。为此，斯坦福大学的研究人员近日开发出一种错误校正方法，能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因。

　　

生物通报道 循环肿瘤DNA（ctDNA）的高通量测序有望实现个性化的癌症治疗。不过，血液中的游离DNA（cfDNA）有限，限制了分析灵敏度。为此，斯坦福大学的研究人员近日开发出一种错误校正方法，能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因。

在周一发表的《Nature Biotechnology》上，研究人员介绍了这种称为集成数字错误抑制（IDES）的方法。它是基于斯坦福团队之前开发的一种ctDNA检测技术，名为CAPP-seq，目前已被罗氏收购。

之前，CAPP-seq技术的检测极限是0.02%，不过许多测序片段都有错误。为了解决这些错误，研究团队首先设计了一种分子条形码策略。许多ctDNA检测开发者也采用这种方案来降低错误率。单链DNA和双链DNA条形码策略都存在，不过都有缺点。双链DNA条形码在降低错误上更佳，但效率不及单链DNA条形码，因此不适合ctDNA量有限的样本。

为此，他们着手设计出一种混合策略。首先，他们设计出测序接头，可用于单链和双链的分子条形码。双链分子的每条链上首先标记一个四碱基条形码，称为索引条形码。接着，他们在两条链的每个接头上添加两个二碱基条形码，称为插入条形码。在测序之后，互补的插入条形码可匹配，重新构建出原始的双链DNA分子。

第二步，斯坦福的团队设计了一种计算工具，可以校正测序或PCR的系统错误。为了实现这一点，他们首先对12名健康成人的样本开展CAPP-seq检测。研究人员报告称，尽管所有种类的SNV都有背景错误，但最常见的是G→T的颠换，而C→T和G→A的错误也有。

他们发现，G→T错误的出现是因为杂交捕获过程中的氧化损伤。他们利用一种计算方法来抑制这些错误。这两种策略的结合，使得错误率下降了15倍，这是通过30个健康对照样本和142个非小细胞肺癌样本证实的。

研究人员也在NSCLS样本上验证了此检测。首先，他们检测了41名晚期NSCLS患者的EGFR热点突变。他们在88个血浆样本中检测到412个EGFR变异，所有变异都已经通过肿瘤活检样本确认。此外，这项检测未检出任何假阳性。

接着，他们在参考细胞系上评估了检测的技术限制。他们创建了参考细胞系混合物，其中变异的等位基因的频率在0.05-1.6%。他们发现，条形码策略和计算校正方法是互补的，结合使用效果更佳。这种方法的理论检测极限是0.00025%。

最后，他们利用这种方法来监控30名NSCLC患者中的突变，这些患者的肿瘤已经过基因分型。研究人员发现，他们能够检测到频率低至0.004%的突变。“据我们所知，这是到目前为止深度测序检测到的最少量ctDNA，”作者写道。（生物通 薄荷）

原文检索

Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA

Nature Biotechnology (2016) doi:10.1038/nbt.3520