快速标识CRISPR系统PAMs的新工具

　　CRISPR-Cas系统被广泛誉为新一代的遗传学工具。但是，这些工具的发展，需要研究人员识别间隔序列前体临近基序（PAMs），它们可开启每个系统的功能。最近，一系列新的技术加快了PAM的识别——早期测试发现，实际上许多CRISPR-Cas系统有多种不同强度的PAMs。

　　

生物通报道：CRISPR-Cas系统被广泛誉为新一代的遗传学工具。但是，这些工具的发展，需要研究人员识别间隔序列前体临近基序（PAMs），它们可开启每个系统的功能。最近，一系列新的技术加快了PAM的识别——早期测试发现，实际上许多CRISPR-Cas系统有多种不同强度的PAMs。延伸阅读：为CRISPR设计高效sgRNA的新方法；基于PCR评估sgRNA特异性的方法。

CRISPR-Cas系统可保护细菌免受入侵者（如病毒）的侵害。它们通过创建与给定入侵者特有DNA序列相匹配的小RNA片段，做到了这一点。当这些CRISPR RNAs找到一个匹配对象时，它们就释放蛋白质，切断入侵者的DNA，从而防止复制。然而，这个过程的第一步不是把RNA与靶DNA相比较。第一步涉及到PAM识别和结合。

PAMs是短的基因序列，临近病毒或其他入侵者中的靶DNA。当一个CRISPR-Cas系统中的蛋白质标识一个PAM时，这种识别会告诉蛋白质与DNA结合，并开始将相邻的DNA序列与CRISPR RNA相比较。如果DNA和RNA匹配，那么蛋白质就会裂解靶DNA。

本文资深作者、北卡罗来纳州立大学的化学和生物分子工程助理教授Chase Beisel指出：“对于将CRISPR-Cas系统用于基因编辑、基因调控或其他技术的研究人员来说，首先需要确定触发特定CRISPR-protein组合的相关PAM序列。”

Beisel说：“例如，与来自于金黄色葡萄球菌的CRISPR-Cas9工具相比，来自于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9工具有不同的PAM。有成千上万的潜在CRISPR工具；为了利用它们，我们需要一种有效的方法来识别它们的PAMs。我们认为，我们开发的工具能够做到这一点。”

PAM的识别是很棘手的，因为我们很难预测哪些遗传序列起的作用是一个给定CRISPR-Cas系统的PAMs。即使在密切相关的CRISPR-Cas系统之间，可发挥PAMs功能的基因序列差别也很大。例如，触发来自链球菌的Cas9蛋白的PAM，由仅仅三个核苷酸组成，但是，触发来自金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白的PAM，则包含6个核苷酸——所有这些都与链球菌的不发生重叠。延伸阅读：CRISPR应用指南：选择哪一种Cas9？[选购宝典]。

本文第一作者、Beisel实验室研究生Ryan Leenay指出：“为了解决这一挑战，我们开发了一种工具，叫做PAM-SCANR。PAM-SCANR可允许我们识别任何给定CRISPR-protein组合的PAM序列。”

PAM-SCANR是如何工作的呢？首先，研究人员从一个他们想找到PAM 的CRISPR-Cas系统开始。然后，相关的CRISPR-protein配对作为高通量筛选中的反应剂，在这个筛选中，CRISPR-protein被同时暴露于许多不同的基因序列。这些基因序列是被设计为变亮的一个遗传构造的一部分——当CRISPR-protein配对与它们结合时，它们就会发出荧光。这种情况只发生在存在一个功能性PAM的时候。

Leenay说：“这种工具的独特之处在于，它可以被用于在大范围的CRISPR-Cas系统中筛选和识别PAMs。”

研究人员在四种CRISPR（已知它们都依赖于PAMs发挥作用）中的三种中，检测了五种CRISPR-Cas 系统的PAM-SCANR。不同的CRISPR类型使用不同的蛋白质，并依赖不同的作用机制。

研究人员还开发了一种工具叫PAM wheel，帮助研究人员可视化PAM-SCANR筛选的输出。它还允许研究人员探究，是否一些PAMs比别的PAMs多，以及多多少。

这很重要，因为在检测PAM-SCANR的过程中，研究人员发现一个给定CRISPR-Cas系统可以有多个PAMs——这让人意外，一些PAMs可比其他PAMs触发更强烈的反应。

本文共同资深作者、北卡罗拉纳州立大学食品、生物工艺和营养科学系助理教授Rodolphe Barrangou说：“当我们在近十年前第一次发现PAMs时，我们最初认为，只有一种PAM起作用。然而，我们的工具表明，一个CRISPR-Cas系统可能有多种PAMs，并且一些PAMs明显比其他表现的更好，作为CRISPR识别其靶DNA的一部分。”

研究人员已经使用PAM-SCANR识别了CRISPR-Cas系统的PAMs，这些CRISPR-Cas系统可能是CRISPR工具的下一代。他们也在努力确定：一个特定CRISPR-Cas系统的不同PAMs，如何可能会影响该系统在任何给定应用程序中的有效性。

Beisel说：“例如，我们想知道，PAMs之间的可变性，是否对基因组编辑以及我们预测脱靶位点的能力产生影响。”

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
The paper, "Identifying and Visualizing Functional PAM Diversity across CRISPR-Cas Systems," will be published online at 12 noon (EST) on March 31 in the journal Molecular Cell.