植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析

　　来自华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的研究人员从Cas9基因与sgRNA表达载体的构建策略，获得基因组定点编辑突变体的转化方法、突变的效率和特征、突变的检测方法等方面进行了总结，最后对植物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑存在的问题以及发展前景进行了讨论。

　　

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生物通报道：基因组定点编辑技术通过可编码核酸酶切割基因组特定位点，进而诱导基因组定点突变。CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑系统由Cas9核酸酶以及sgRNA(Single guide RNA)组成，与其他可编码核酸酶系统如锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)相比具有更简便的操作性和更高的基因组定点编辑效率。目前在植物中已有多例应用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的报道。

近期来自华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室的研究人员从Cas9基因与sgRNA表达载体的构建策略，获得基因组定点编辑突变体的转化方法、突变的效率和特征、突变的检测方法等方面进行了总结，最后对植物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑存在的问题以及发展前景进行了讨论。

在生命科学领域，突变体对于基因功能研究具有至关重要的作用。传统的随机诱变方法往往需要构建大群体的突变体库，并进行大规模筛选才能获得目的基因丧失功能的突变体。这一过程需要大量的人力与物力。与之相比，直接在基因组特定位置引入突变的方法，即基因组定点编辑技术无疑具有巨大优势。

新近发展的序列特异性核酸酶(Sequence specific nuclease, SSN)，如锌指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator like effector nucleases, TALENs)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)，通过在生物体基因组特定位置引入染色体双链断裂(Double strand break, DSB)进而引发生物体内源的非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复。易错的NHEJ修复往往导致修复位点产生小片段DNA的插入或者缺失，如果插入或者缺失发生在基因的编码区，就会造成目的基因的移码突变。

与突变体库筛选相比较，基因组定点编辑技术针对性强，省去了后续的大规模群体筛选工作，能极大提高获得目的基因突变体的效率。序列特异性核酸酶中的ZFNs与TALENs都是融合DNA识别结构域(锌指或者TAL效应子)与核酸酶结构域而形成的嵌合蛋白，一般需要二聚化才能发挥作用。组装ZFNs与TALENs的DNA识别结构域的表达单元都相对复杂，而且重复性较差。而CRISPR/ Cas9系统由sgRNA(Single guide RNA)与Cas9蛋白两个元件组成。sgRNA 5′端的20个碱基通过碱基互补配对的方式决定靶序列，Cas9蛋白负责切割靶序列，因而构建表达单元十分简便。应用CRISPR/ Cas9对动植物进行基因组编辑的报道大大超过了ZFNs与TALENs，CRISPR/Cas9成为基因组编辑技术的一个新突破。在植物中已经有多篇关于CRISPR/Cas9系统的验证以及应用的报道。

为此研究人员总结了植物CRISPR/Cas9表达载体系统及其应用、基因编辑突变的检测与分析方法，并展望了CRISPR / Cas9系统在植物中的发展前景。

作者指出，CRISPR/Cas9技术系统的出现，将大大改变反向遗传学中获得突变体的方式和分子育种的策略。然而，通过突变体库筛选突变体，并通过正向遗传学手段克隆功能基因的策略仍将继续发挥作用。对CRISPR/Cas9系统的理论研究也取得重要进展，如解析了Cas9与sgRNA结合DNA的晶体结构，以及对Cas9蛋白的各种修饰相继被报道。

最近，美国麻省理工学院和哈佛学院的张峰博士实验室又鉴定出2种与Cas9蛋白具有相似功能、同样来源于CRISPR系统的Cpf1蛋白，形成了CRISPR/Cpf1系统。Cpf1的PAM特异性以及切割方式都不同于Cas9，这一发现无疑是对基于CRISPR基因组编辑技术的重要补充。CRISPR/Cas9及其相关技术系统的发展将对植物的基础研究与应用产生革命性的影响。然而，人们也产生了对此技术可能被滥用的担忧。但与医学以及动物研究相比，植物基因组修饰涉及的基础与应用研究不涉及伦理问题，植物中应用CRISPR/Cas9系统具有更大的自由度。

从生物学原理上讲，基于CRISPR/Cas9等的基因组编辑技术的基因定点突变与传统的基因随机突变(自然突变或人工诱变)的性质具有实质等同性，但基因组编辑定点突变更具有针对性和效率性。并且，通过后代的遗传分离可以获得不含转基因元件的突变株系，因此基因组编辑技术应当比传统的诱变育种方法具有更高的安全性。

目前基于CRISPR/Cas9系统的植物基因组修饰主要是对特定位点的突变和2个靶点之间的片段缺失，一般产生目标基因的功能丧失。而对植物基因组特定序列进行精确的替换、插入、和缺失操作，并且产生可遗传植株的技术难题尚未完全解决。因此，发展这种更高层次的基因组修饰技术无疑是今后的努力方向。

（生物通）

原文检索：

植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析 马兴亮,刘耀光 DOI: 10.16288/j.yczz.15-395 2016 Vol. 38 (2): 118-125