华裔学者开发新型CLIP技术

　　有数以百计的蛋白质可以与RNA结合，但是弄清有哪些蛋白在哪里结合RNA，以及它们相互作用之后发生了什么，一直都是一个挑战。最近，加州大学圣地亚哥分校的华裔学者Gene W Yeo及其同事创建了加强型的CLIP (eCLIP)，来解决这些问题。

　　

生物通报道：有数以百计的蛋白质可以与RNA结合，但是弄清有哪些蛋白在哪里结合RNA，以及它们相互作用之后发生了什么，一直都是一个挑战。延伸阅读：Cell特辑：免疫沉淀；染色质免疫沉淀测序技术获突破。

除了转录调控之外，还有更多的基因调控。随着研究人员越来越意识到RNA所扮演的不同角色，寻找这些核酸和RNA结合蛋白(RBPs)之间的相互作用，就显示出更大的重要性。数以百计的RBPs是已知的——其中很多涉及各种疾病，如神经退行性变、自身免疫缺陷和癌症，但是大部分仍有待于发现。发现RBPs结合的序列，可以阐明它们调控RNA转运、处理以及翻译的机制。

发现RBPs结合位置的最先进的方法，依赖于核糖核蛋白复合物的交联和免疫沉淀反应(CLIP)，然后进行测序。这些程序在技术上具有挑战性，需要放射性，实验的失败率很高，并会产生高百分比的重复读取。加州大学圣地亚哥分校的Eric Van Nostrand和Gene W Yeo在一封电子邮件中说道：“当执行大规模CLIP实验作为ENCODE联盟的一部分时，我们认为，当前方法没有足够的能力分析数以百计的因素。”他们及其同事创建了加强型的CLIP (eCLIP)，来解决这些问题。Gene W Yeo（姚伟明，音译）是加州大学圣地亚哥分校华裔学者，其负责的科学实验室主要研究RNA在调节人体正常及肿瘤干细胞生物学和神经分化方面的影响，包括计算生物基因组、建立RNA、干细胞生物学及疾病模型。

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eCLIP从ChIP-seq借鉴了它的两步多路复用库制备技术。首先，研究人员将一个有索引的3’适配子（可允许随后的汇集），与附着于免疫沉淀反应珠子上的RNA片段连接起来。然后，他们通过电泳和消化掉蛋白质，分离了复合物。在反转录RNA后，他们在PCR扩增之前，将另一个包含内联随机5-或10-mer的3 '适配子，连接到现在的单链DNA上。

逆转录往往会在交联部位终止，这可让研究人员获得核苷酸分辨率。在相同的顺序读取的情况中，随机单链DNA适配子序列，将能够区分来自PCR副本的独特片段，让后者被丢弃，从而使映射读取的数量更为定量，并减少了浪费的测序。此外，eCLIP为非特异性背景和固有偏误，添加了一个大小匹配的免疫沉淀反应前对照。

这些修改意味着，为了获得更高比例的可用读数并产生具有足够复杂性的文库，eCLIP需要的扩增比其他方法少大约1000倍，以识别更混杂的RBPs所使用的序列。现在，我们可以使用这些序列，来弄清RBPs如何完成它们的作用。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP)
Abstract: As RNA-binding proteins (RBPs) play essential roles in cellular physiology by interacting with target RNA molecules, binding site identification by UV crosslinking and immunoprecipitation (CLIP) of ribonucleoprotein complexes is critical to understanding RBP function. However, current CLIP protocols are technically demanding and yield low-complexity libraries with high experimental failure rates. We have developed an enhanced CLIP (eCLIP) protocol that decreases requisite amplification by ~1,000-fold, decreasing discarded PCR duplicate reads by ~60% while maintaining single-nucleotide binding resolution. By simplifying the generation of paired IgG and size-matched input controls, eCLIP improves specificity in the discovery of authentic binding sites. We generated 102 eCLIP experiments for 73 diverse RBPs in HepG2 and K562 cells (available at https://www.encodeproject.org), demonstrating that eCLIP enables large-scale and robust profiling, with amplification and sample requirements similar to those of ChIP-seq. eCLIP enables integrative analysis of diverse RBPs to reveal factor-specific profiles, common artifacts for CLIP and RNA-centric perspectives on RBP activity.