利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑

　　CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。来自中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所的研究人员利用CRISPR/Cas9平台，在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑。

　　

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生物通报道：CRISPR/Cas9技术提供了一个全新的基因组编辑体系。来自中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所的研究人员利用CRISPR/Cas9平台，在人胚胎干细胞株中对选取的一段特定基因组区域进行了多种基因组编辑。

基因组测序技术的发展极大推动了人类对各类疾病遗传致病因素的认识。针对多种疾病进行的外显子测序(Exome sequencing)和全基因组关联研究(Genome-wide association study, GWAS)提示很多新的基因突变和疾病发生具有强烈相关性。深入解析这些遗传突变，并建立携带特定遗传突变的疾病模型用于针对性的药物筛选，将极大提高对疾病致病机理的认识和加速疾病防治方案的开发。

人类多能干细胞(Human pluripotent stem cells, hPSCs)和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研究提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研究人员可以研究特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins9,CRISPR/ Cas9)技术的飞速发展。

目前常用的CRISPR/Cas9平台是从化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR系统优化而来，由SpCas9核酸酶和gRNA构成。其中SpCas9核酸酶识别基因组中的PAM (Protospacer adjacent motif)序列，gRNA中长约20 bp的引导序列决定靶向特异性。当基因组上位于PAM 5′端的前体间隔序列(Protospacer)与gRNA中的引导序列互补时，Cas9核酸酶启动对DNA双链进行切割，形成DNA双链断裂缺口(Double-strand breaks, DSBs)。DSBs能激活细胞内非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)和同源重组(Homology directed repair, HDR)两种DNA修复机制。NHEJ修复过程可以引入碱基的随机插入或者缺失(Insertion or deletion)；而在外源模板存在的情况下，细胞也可以通过HDR的方式对基因组进行精确修复。

在这篇文章中，研究人员利用CRISPR/Cas9技术，建立了在人多能干细胞中进行基因敲除或者敲入的基因组编辑体系。研究以位于人2号染色体上的LINC00116基因组区域为例，利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞中的该基因组区域进行了基因敲除、FLAG短肽序列定点插入和基因组大片段删除，获得的多个突变干细胞株为下一步对该基因组区域进行功能分析提供了特有的细胞平台。

这项研究的重要性表现在：通过在基因编码框中引入移码突变进行基因敲除;通过单链DNA提供外源模板经由同源重组定点敲入FLAG序列;通过同时靶向多个位点诱导基因组大片段删除。研究结果表明CRISPR/Cas9可以对多能干细胞进行高效基因编辑,获得的突变干细胞株有助于对基因和基因组区域的功能进行分析和干细胞疾病模型的建立。

利用CRISPR对多能干细胞中多个基因组区域进行靶向的研究结果显示，经由NHEJ引入碱基插入或缺失突变的效率均大于50%，提示利用CRISPR技术可以进行高效的基因敲除，甚至多个基因的同时敲除。

这项研究在由同源重组敲入特定点突变或者外源序列方面，通过单链核苷酸模板定点敲入FLAG小肽序列的效率偏低，仅为1.1%。后期或可尝试从以下几个方面提高重组效率：(1)增加单链核苷酸模板中同源臂的长度。文章中单链核苷酸模板两边同源臂长度为50 bp，但受单链核苷酸体外合成长度的限制(目前≤200 bp)，同源臂长度一般小于100 bp；(2)构建质粒载体作为外源模板。利用质粒载体可以大幅度增加同源臂长度，并且可以引入抗性基因表达框经由药物筛选富集成功重组的细胞。研究组前期通过两边携带500 bp 长度同源臂和嘌呤霉素(Puromycin)筛选基因的质粒载体成功在多个基因组位点定点插入GFP 报告基因，阳性克隆效率>60%(未发表数据)；(3)提高gRNA的靶点活性。筛选更高活性的gRNA 靶向序列可能有助于提高重组效率；(4)抑制NHEJ过程。由于细胞在DNA修复过程中NHEJ和HDR是两个相互拮抗的过程，抑制NHEJ过程可以相应提高HDR效率。多个研究组已经成功通过体外筛选找到抑制NHEJ修复过程的小分子化合物。在基因靶向同时通过此类小分子化合物处理细胞，可以达到增强HDR过程而提高DNA序列敲入效率的目的。

研究还利用同时导入两条gRNA对基因组区域进行了大片段靶向删除，效率约为5%。靶 向删除基因组大片段的效率不仅和每条gRNA的基因编辑活性相关，同时也和片段长度相关。靶向删除片段长度的增加可能带来效率的降低。此外，导入两条或者多条gRNAs，不仅可以引入基因组区域缺失，同时还可以引发其他多种染色体结构变异，包括染色体区域插入(Insertion)、重复(Duplication)、易位(Translocation)和倒位(Inversion)等，为模拟染色体结构变异导致的人类疾病提供了一个合适的平台。基因靶向潜在的问题是脱靶效应。

这一研究组和其他研究组前期通过对靶向得到的干细胞单克隆株进行全基因组测序分析脱靶情况。结果显示TALEN和CRISPR靶向后得到的干细胞克隆中脱靶率均很低，提示在保证靶向序列的高度特异性、控制基因编辑蛋白表达强度和时间的情况下，脱靶现象是可以避免的。值得注意的是，在全基因组测序中，研究人员发现很多单克隆(包括突变株和同批的野生型细胞株)，相比编辑前的干细胞母株，产生若干新的点突变。由于这些点突变附近基因组序列和靶向序列没有任何相似性，因此推测是在细胞培养和传代中随机发生，其中少数位于基因编码区而造成氨基酸突变。这种随机突变的获得提示基因靶向后获得的每个单克隆都可能存在靶向引入突变外的基因组序列上的差别。因而，在建立干细胞疾病模型对特定基因突变进行功能分析时，为避免这种随机突变对细胞表型的影响，实验设计需要对多个野生型和突变型克隆同时进行表型比对，在多个干细胞母株中进行疾病模型建立，并利用多种对照组设计(如在基因敲除克隆中通过引入外源质粒恢复基因表达)等进行综合分析。

CRISPR基因组编辑技术平台由于载体构建简单、靶向位点选择灵活、靶向效率稳定，目前已经被广泛用于各类细胞和模式动物的基因组编辑，它在干细胞平台中的应用潜力也远远超出了这篇文章涉及的这几个方面。可以预见，基因组编辑技术和干细胞平台的结合将极大提高人们对生命科学的认识，推动精准医疗发展，加速细胞治疗和基因治疗等新一代医药方案的开发。

（生物通）

原文检索：

刘改改,李爽,韦余达,张永贤,丁秋蓉. 利用CRISPR/Cas9技术对人多能干细胞进行高效基因组编辑[J]. 遗传, 2015, 37(11): 1167-1173.
Gaigai Liu,Shuang Li,Yuda Wei,Yongxian Zhang,Qiurong Ding. Efficient genome editing in human pluripotent stem cells through CRISPR/Cas9. HEREDITAS(Beijing), 2015, 37(11): 1167-1173.