Cell发布突破性CRISPR新技术

　　马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所的Ryohei Yasuda博士和他的研究小组开发出了一种他们命名为SLENDR（通过CRISPRCas9介导的同源指导修复单细胞标记内源性蛋白）的方法，可利用它来精确改造活体样品中的神经元DNA。

　　

生物通报道  马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所的Ryohei Yasuda博士和他的研究小组，正在致力于了解当我们学习和形成记忆时大脑中的细胞发生改变的方式。然而由于缺乏能够让科学家们定位及显像单个神经元中个体蛋白的技术，这方面的研究一直受到限制。

当前的成像方法无法提供足够强大至可以看到各式各样蛋白的特异性、对比度和分辨率。加上，它们费时且昂贵；开发这些工程模型可能需要一年或两年的时间。然而当Jun Nishiyama博士与Takayasu Mikuni博士阅读了2014年开发出来的一项突破性DNA编辑技术CRISPR/Cas9的信息时，他们有了一个主意。

CRISPR是内置于细菌DNA中的一种工具，单细胞生物利用它来对抗感染。当病毒侵袭并试图将它的感染性DNA插入到细菌细胞的DNA中去时，细菌DNA的特定部分CRISPR会切割病毒DNA，使得它无法造成严重破坏。

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科学家们已开始利用CRISPR/Cas9在细胞及除细菌之外的生物体中破坏特定基因。当发生这种损伤之时，细胞会利用两种方法来修复它的DNA。一种是同源指导修复(HDR)，另一种是非同源末端连接(NHEJ)。HDR更为精确，会重建或替换受损基因，而NHEJ会降解受损基因，重新连接剩下的片段末端，往往会删除受损基因表达，而非替代它。

如果细胞利用HDR来修复自身，科学家们可以将目的基因纳入到CRISPR系统，CRISPR系统将会插入到DNA中替换受损基因。许多研究人员认为，一旦细胞停止分裂，它通常会采用NHEJ而非HDR来修复受损DNA。

尽管CRISPR系统具有过人的能力，一直以来在操控脑细胞DNA方面却少获成功，这是因为当大脑形成之时，它的细胞就不再分裂。当科学家们可以相对容易地利用CRISPR来敲除大脑中的某些基因时，缺乏细胞分裂使得它们很难通过HDR以可靠的精度敲入目的基因。

Yasuda和他的研究小组开发出了一种他们命名为SLENDR（通过CRISPRCas9介导的同源指导修复单细胞标记内源性蛋白）的方法，可利用它来精确改造活体样品中的神经元DNA。在实验模型中，该研究小组利用了子宫内电穿孔技术——使得他们能够将CRISPR/Cas9系统插入到仍然在发育及分裂的胎儿期脑细胞中。因此，断裂DNA仍然是通过HDR进行修复，这允许了研究人员添加进一个使得目的蛋白在显微镜下可见的基因。他们甚至可以在同一细胞中同时用不同的颜色可靠地标记两种不同的蛋白。研究人员利用各种成像方法以及DNA测序证实了SLENDR方法可以真实、精确地敲入基因。

在测试这一新技术的同时，该研究小组观察到了蛋白激酶C α亚型从前未描述的行为。在发育早期，大约出生后7天，它在细胞膜上聚集，表明了它高度活化，而在出生后一个月，它遍及整个细胞，表明在发育晚期它不再高度活化。

Yasuda说：“我相信SLENDR将会成为分子和细胞神经生物学的一个标准工具。SLENDR提供了一种宝贵的工具来确定蛋白质的亚细胞定位，将帮助研究人员确定蛋白质的功能。”

基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法，靶向及追踪活细胞中RNA的活动。发布在2016年3月17日Cell杂志上的这一新方法，有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程，及操控基因转录进行疾病建模（Cell重要突破：首次利用CRISPR技术追踪RNA ）。

来自麻省大学医学院的科学家开发出了一项利用CRISPR/Cas9的新技术：CRISPRainbow，它使得研究人员能够在活细胞中标记和追踪7个不同的基因组位点。这一标记系统将成为实时研究基因组结构的一个宝贵的工具，研究人员在2016年4月的Nature Biotechnology杂志上发布了关于它的详细资料（马涵慧博士Nature Biotechnology：突破性CRISPR新技术 ）。

由日本大阪大学医学研究生院实验动物科学研究所副教授Tomoji Mashimo，及日本信息与系统研究组织国立遗传学研究所小鼠基因组学资源实验室助理教授Kazuto Yoshimi领导的一个研究小组，开发出了两种基因改造新技术：lsODN（long single-stranded oligodeoxynucleotide）和2H2OP(two-hit two-oligo with plasmid)）。这两种方法利用了CRISPR-Cas系统和ssODN（单链寡核苷酸）。他们的研究论文发布2016年的Nature Communications杂志上（Nature子刊：新型CRISPR大片段基因敲入技术 ）。

（生物通：何嫱）

生物通推荐原文摘要：

High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing

A scalable and high-throughput method to identify precise subcellular localization of endogenous proteins is essential for integrative understanding of a cell at the molecular level. Here, we developed a simple and generalizable technique to image endogenous proteins with high specificity, resolution, and contrast in single cells in mammalian brain tissue. The technique, single-cell labeling of endogenous proteins by clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9-mediated homology-directed repair (SLENDR), uses in vivo genome editing to insert a sequence encoding an epitope tag or a fluorescent protein to a gene of interest by CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair (HDR). Single-cell, HDR-mediated genome editing was achieved by delivering the editing machinery to dividing neuronal progenitors through in utero electroporation. We demonstrate that SLENDR allows rapid determination of the localization and dynamics of many endogenous proteins in various cell types, regions, and ages in the brain. Thus, SLENDR provides a high-throughput platform to map the subcellular localization of endogenous proteins with the resolution of micro- to nanometers in the brain.