首次用CRISPR来推动代谢工程

　　最近，美国伦斯勒理工学院(RPI)的研究人员，开发出了新的工具用于控制细胞中的信号通路，来制造化合物，从而降低不需要的化合物的生产，并提高有价值的化合物的产量。这项研究发表在最近的《Nucleic Acids Research》杂志。

　　

生物通报道：发现CRISPR/Cas9基因编辑方法的一种变体的控制规则，就有可能使用活细胞来制造有价值的代谢化合物，如药品和保健品。最近，美国伦斯勒理工学院(RPI)的研究人员，开发出了新的工具用于控制细胞中的信号通路，来制造化合物，从而降低不需要的化合物的生产，并提高有价值的化合物的产量。

这项研究发表在最近的《Nucleic Acids Research》杂志，描述了CRISPR / Cas9基因编辑方法的一个方面，这种方法利用dCas9——一种有缺陷的蛋白质。具体而言，研究人员描述了如何改变一个RNA片段来创建多种使用dCas9的工具，每种工具都有能力沿着复杂的多步骤信号通路阻止单个位点上的活性，而没有串扰。

这项研究的通讯作者Mattheos Koffas指出：“CRISPR是其中一种最强大的、可用的基因编辑技术，但直到现在，我们只看到它在医疗保健的应用（相关阅读：Nature子刊：CRISPR在癌症研究中的新应用；Nature：CRISPR技术的应用舞台）。这是其第一个真正的代谢工程应用，使用这种基因编辑方法来生产高值产品。你可以想象，在未来10年后，人们可能会控制一个生物体中成千上万的基因，生产很有价值的产品。”相关阅读：用转基因番茄工业化生产天然化合物。

CRISPR/Cas9系统来源于细菌用以攻击熟悉病毒的一种自然防御机制。CRISPR是包含来自之前接触的病毒DNA的细菌DNA。当已知的病毒DNA侵入细胞后，细菌就利用CRISPR来产生一段“引导RNA”，它将与病毒DNA相匹配或补充。引导性RNA与Cas9蛋白质复合体相结合，这会切断DNA。如此装备一番，Cas9可以解压缩、抓住并切断互补的病毒DNA，从而抑制它。CRISPR/Cas9已被用于健康应用，比如抑制特定基因生产转基因动物，用于研究。

CRISPR/Cas9还拥有巨大的潜力，可作为控制信号通路的一种方式，细胞通过这种复杂的化学通信，执行大多数功能，并制造必要的物质。在每条信号通路中，DNA中包含着许多步骤的指令。如果该进程可以在每一步上受到控制——通过阻止或允许DNA在启动子区的转录，细胞的输出也就可以被控制，从而重新定向其能源，生产所需的化合物。CRISPR / dCas9方法的一个变体，可通过使用一种有缺陷的Cas9蛋白来抓住靶DNA并保持在适当位置，而阻断转录，从而阻碍了进一步转录特定DNA片段中的指令。

本文第一作者Brady Cress指出：“细胞是一个工厂，我们可以接管生产，制造我们想要的东西。利用CRISPR/dCas9，我们能做的就是，通过关闭竞争途径，更为普遍地制造出重要的化合物——那些制备大量高值化合物所需要的化合物。”

虽然CRISPR方法在代谢工程中有巨大的前景，但是，还需要更好地理解它的全部潜力。这项研究的一个领域涉及“串扰”风险——当用于一个启动子的靶RNA错误地结合另一段相似序列的启动子时，会发生这种并发症，从而使其激活或阻断极为复杂的通路的其他部分。

DNA是由四个核苷酸（胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤或胸腺嘧啶）组成的一条链，每种核苷酸都与四种RNA核苷酸中的一种互补。为了让CRISPR / Cas9系统抓住DNA并执行其任务，引导RNA序列的核苷酸必须与目标DNA互补。但是，一种准确匹配并不总是必要的——一个或更多的核苷酸可能是错误的，并指导RNA，靶DNA可能仍然依附，但未完成。系统用来控制不匹配程度的规则，尚不明确。例如，在一条20个核苷酸的链中，如果有一个错配的核苷酸，引导RNA将抓住靶DNA吗？如果有两个或三个会怎样？

一个容忍许多不匹配的系统，可增加一条信号通路的串扰，因为一条引导RNA结合多个启动子。然而，如果系统允许更少的不匹配，串扰的风险就会较少，研究人员可以改变启动子和互补引导性RNA上的仅仅少数序列，来轻松地创建多种工具。因为有四种核苷酸，每种不匹配可产生不止一种工具的机会。

Cress检测了一段20个核苷酸的启动子，专注于一个特定序列部分中的一系列三核苷酸。他以高通量的方式，系统地连续改变了多达三个碱基对，以了解需要多少不匹配才能防止串扰。Cress发现，在三核苷酸序列中，该系统将结合一种不匹配，但不会结合两种或三种不匹配。

Linhardt说：“这是一个重要的发现，因为它可让你设计某种工具，在同一时间控制不同的基因，而没有任何串扰。这些途径是复杂的，我们必须能够触及任何途径的多个部分，来保持细胞存活和控制输出。所以现在，我们可以创建大量的工具——几十种，它们是基于相同的启动子，并可以单独控制。”

作为概念验证，Cress遵循新规则，将启动子并入到一个模型通路细胞中，用其制备不同的化合物（无色、紫色、绿色，取决于激活的通路部分）。他制备了通路不同部分被激活的细胞，并且产生了所预测的颜色的化合物。

（生物通：王英）

生物通推荐原文：
Brady F. Cress et al. Rapid generation of CRISPR/dCas9-regulated, orthogonally repressible hybrid T7-lac promoters for modular, tuneable control of metabolic pathway fluxes in , Nucleic Acids Research (2016). DOI: 10.1093/nar/gkw231