南京师大用CRISPR制备基因敲除小鼠

　　5月3日，来自南京师范大学、无锡兰诺生物技术有限公司（Lannuo Biotechnologies Wuxi Inc.）和美国Renova Life, Inc.的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Efficient generation of FVII gene knockout mice using CRISPR/Cas9 nuclease and truncated guided RNAs”的研究成果。

　　

生物通报道：CRISPR RNA引导的核酸酶（RGNs）可以稳健地诱导基因组编辑。通过非同源末端的、RGN诱导的双链断裂修复或同源性修复，可引入插入或缺失突变或特定的序列变化。酿脓链球菌Cas9核酸酶（Cas9）可通过一个单导向RNA（gRNA，在其5′末端具有一段20核苷酸（nt）的靶向互补区域），裂解介入的间隔区序列。然而，在序列末端可能诱导不希望得到的脱靶诱变，类似于脱靶位点。延伸阅读：减少CRISPR-Cas9脱靶效应的新方法；CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估。

已有研究报道过几种策略来提高Cas9系统的特异性，如配对的Cas9切口酶方法，在这种方法中，两个gRNAs靶定相反DNA链上的相邻站点，每一个gRNA招募一个Cas9切口酶，其切割DNA而不是双链。这种方法可以在单gRNA引导的Cas9诱导的位点上诱导脱靶修饰。然而，仍然有脱靶突变被观察到，一个额外的gRNA可以引入新的脱靶突变位点。每一个gRNA能独立切割脱靶位点上的DNA，从而导致不必要的全基因组突变。二聚的CRISPR RNA引导的FokI核酸酶(RFN)策略，可以将脱靶突变减少到检测不到的水平，但它也会减少打靶的插入率。成对的Cas9切口酶和RFNs需要被适当地设计，并面向它们配对的gRNAs，这在靶基因之间可能有所不同，因此，在复合应用程序中提出了技术挑战。

最近的研究报告表明，截短的gRNAs(tru-gRNAs)，可通过将gRNAs缩短至17/18 nt，改善U2OS. GFP和FT-HEK293细胞的Cas9核酸酶特异性。他们发现，标准gRNA(std-gRNAs，20 nt)活性，不需要5′端核苷酸，在多余的位置补偿不匹配，以及gRNA靶向DNA接口，如较短的gRNAs对不匹配更敏感，因此表现出更高的特异性。这个假设已经在培养细胞得以证实，然而，tru-RGNs能否在动物模型中实现高效的基因敲除 (KO)，目前尚不明确。

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5月3日，来自南京师范大学、无锡兰诺生物技术有限公司（Lannuo Biotechnologies Wuxi Inc.）和美国Renova Life, Inc.的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》发表题为“Efficient generation of FVII gene knockout mice using CRISPR/Cas9 nuclease and truncated guided RNAs”的研究成果。南京师范大学生命科学学院杜福良教授是本文通讯作者。

在这项研究中，研究人员调查了5′端截短的CRISPR RNA引导性Cas9核酸酶（tru-RGN）对NIH/3T3细胞中基因组编辑能力的影响，及其生成Factor VII (FVII)基因敲除（KO）小鼠的效率。在培养细胞中，当gRNAs被截短时，RGNs脱靶编辑活性有所不同，在两个位点更高（tF7–2 vs. F7–2, 49.5 vs. 30.1%），而在其他两个位点更低（Site One, tF7–1 vs.F7–1, 12.1 vs. 23.6%; Site Three, tF7–3 vs.F7–3, 7.7 vs 10.9%）。

在15个推断的脱靶位点，tru-RGNs在5位点表现出显著降低的频率。通过显微注射，将tru-RGN RNA注入受精卵，比标准RGN控制更加高效地生成了FVII KO小鼠。FVII敲除小鼠表现出前凝血酶时间延迟，血浆FVII表达降低。

这项研究首次表明，截短到18个互补核苷酸的gRNAs和Cas9核酸酶，能够以一种不依赖于位点的方式，以更高的效率生成FVII基因敲除小鼠。此外，通过RGN表达载体介导的基因组编辑，KO小鼠中的脱靶频率低于细胞系。

上个月，来自复旦大学生命科学学院,遗传工程国家重点实验室等处的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行FⅨ基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径。相关阅读：利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型。

（生物通：王英）
杜福良博士简介：1984年自南京师范大学毕业，曾任扬州大学农学院(江苏农学院) 讲师, 副研究员, 并参加国家七五、八五、863等重点生物技术攻关项目。1994年赴美国康奈尔大学(Cornell University) 动物科学系从事胚胎工程，克隆及基因转移的研究。2000年获康奈尔大学遗传与分子生物学博士。杜博士是国际知名的动物克隆和转基因动物专家，在国内工作期间，完成制作中国首例转基因兔（1990）和克隆山羊（1995）。两次获国家科委中国科学院科技进步一等奖，1991年获国家计委，国家科委和财政部嘉奖，表彰他为国内转基因动物研究作出的开创性贡献。2002年起创建美国Evergen生物技术公司，历任研发副总裁（VP，Research & Development），首席科技长官（Chief Scientific Officer）。负责包括体外受精的动物生物工程、转基因动物制作、动物克隆技术以及基因敲除(knockout) 等高新技术的研究与开发。在中文杂志和国际英文刊物上共发表科学论文50多篇。他领导开发了奶牛性控胚胎生产、玻璃化冷冻等一系列世界首创的胚胎生物技术，并于近期成功的将其中一项技术以接近四百万美元的费用转让。自2004年起作为项目负责人或共同负责人从美国国立卫生研究院获得超过五百万美元的创新技术研究经费。2007年与美国GTC公司合作建立人凝血因子7转基因兔生物反应器，2008年与英国伦敦大学圣乔治医学院合作完成抗艾滋病的转基因兔动物模型。2005年至2009年间历年获得美国康涅狄格州州长颁发的科技创新奖。2009年创建美国Renova生物制药公司(Renova Life Inc)，并任总裁。

生物通推荐原文摘要：
Efficient generation of FVII gene knockout mice using CRISPR/Cas9 nuclease and truncated guided RNAs
Abstract: We investigated the effects of 5′-end truncated CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease (tru-RGN, 17/18 nucleotides) on genome editing capability in NIH/3T3 cells, and its efficiencies on generating Factor VII (FVII) gene-knockout (KO) mice. In cultured cells, RGNs on-target editing activity had been varied when gRNAs was truncated, higher at Site Two (tF7–2 vs. F7–2, 49.5 vs. 30.1%) while lower in other two sites (Site One, tF7–1 vs.F7–1, 12.1 vs. 23.6%; Site Three, tF7–3 vs.F7–3, 7.7 vs 10.9%) (P < 0.05). Out of 15 predicated off–target sites, tru-RGNs showed significantly decreased frequencies at 5 sites. By microinjecting tru-RGN RNAs into zygotes, FVII KO mice were generated with higher efficiency at Site Two (80.1 vs. 35.8%) and Site One (55.0 vs 3.7%) (P < 0.05), but not at Site three (39.4 vs 27.8%) (P > 0.05) when compared with standard RGN controls. Knockout FVII mice demonstrated a delayed prothrombin time and decreased plasma FVII expression. Our study first demonstrates that truncated gRNAs to 18 complementary nucleotides and Cas9 nucleases, can effectively generate FVII gene KO mice with a significantly higher efficiency in a site-dependent manner. In addition, the off-target frequency was much lower in KO mice than in cell lines via RGN expression vector-mediated genome editing.