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Cell社论:基因组编辑工具升级版
【字体: 大 中 小 】 时间:2016年06月15日 来源:生物通
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最开始,CRISPR-Cas基因组编辑技术很大程度上依赖于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9),但这种Cas9相对来说“个头”比较大,会阻碍病毒传递和细胞表达。
生物通报道:基于原核 CRISPR-Cas 免疫系统的基因组编辑技术是近几十年来最强大的生物学技术突破之一,这种工具能对许多种类的生物进行精确的遗传改变,为基础研究,生物技术和临床医学带来了巨大的希望。
最新一期(6月2日)Cell杂志介绍了这种技术工具的最新升级改造,指出通过改进Cas9酶和重编程新酶,研究人员能获得更加适合不同基因组编辑应用的新工具,这也加速了其在临床上的应用。
应该说CRISPR-Cas系统是继Meganuclease、锌指酶和TALEN之后,又一通过各自的DNA结合域来靶向目的序列,不过这一技术使用RNA为核酸酶导航,不仅很容易设计,而且能够改写几乎任何基因组序列。但是这并不是说CRISPR-Cas就没有自己的局限性了,不过幸运的是,不少研究人员取得了显著进展,优化了 Cas9,提高了这一技术的灵活性、保真性和精度。
最开始,CRISPR-Cas基因组编辑技术很大程度上依赖于化脓性链球菌Cas9 (SpCas9),但这种Cas9相对来说比较大,会阻碍病毒传递和细胞表达。2015年两个研究组发现了两个更小一些的Cas9同源物,即来自金黄色葡萄球菌和嗜热链球菌中的Cas9,这令真核系统进一步编辑更为高效。
SpCas9识别的是任何核苷酸后面的两个鸟嘌呤DNA碱基PAM序列。这将SpCas9靶向的PAM序列局限为必须包含两个连续鸟嘌呤的DNA序列。为了解决这一问题,麻省总医院研究小组建立了一个工程系统,使得他们能够快速地演化SpCas9识别不同PAM序列的能力。通过收集随机突变的SpCas9变体,他们鉴别出了使得SpCas9能够新PAM序列的突变组合。这些演化变体基本上让SpCas9可以进行靶向基因编辑的位点范围扩大了一倍。
CRISPR-Cas系统另一个重要的改进就是减少脱靶效应,这对于临床应用尤为重要。目前已经报道了多种增加Cas9 特异性的方法,其中最显著的是由张锋和Keith Joung领导完成的一项成果:随后任意组合改变1条、2条、3条或4条氨基酸侧链,测试了总共15种可能的变异体,发现了一种三个位点发生替代的变异体:SpCas9-HF1(SP代表化脓链球菌,是这一广泛使用的Cas9的来源,HF代表高保真),相比于未改变的原始SpCas9,在研究人员测试的37种不同的导向RNAs中,这一变异体采用85%的导向RNAs诱导出了靶向效应。
除了SpCas9-HF1,这组研究人员还发现三个氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。利用测试的导向RNAs,他们证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。研究小组将这种新设计的酶命名为“增强型”化脓性链球菌Cas9( eSpCas9 ),可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。
然而,对于基因组编辑来说最大的挑战也许应该是DNA序列精确替换的相对低效率。
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Cas9介导的双链DNA断裂(DSB)插入新设计序列中的分辨率,在理想的情况下会包含同源指导修复(HDR),但是这种修复通路只有很少的机会被用于容易出现错误的非同源末端连接(NHEJ,注释见下)。这样得到的序列常常会出现插入或者删除(indels)。
而且如果HDR替换了一个基因组位点,那么就更加容易被Cas9重复切割,导致出现不必要的突变indels。对此可以考虑一种解决方法,那就是涉及供给模版,替换PAM序列或者导向RNA靶向序列中的突变,阻止第二次切割。不过这与通过HDR引入的突变不同,这些“阻断突变”会在基因组中留下“疤痕”,引发意想不到的后果。
上个月发表在Nature杂志上的一篇文章中,来自洛克菲勒大学的研究人员开发出了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑框架,它能以高效率及精度选择性引入单等位基因和双等位基因序列改变。研究人员证实通过整合一些阻断CRISPR/Cas的沉默突变及致病突变,可以显著提高HDR的精度,并建立了一种叫做“CORRECT”的方法来实现无痕基因组编辑。
利用这种方法,他们构建出了具有杂合子和纯合子显性早发阿尔茨海默病致病APPSwe和presenilin 1 (PSEN1M146V)突变的人类诱导多能干细胞及衍生的大脑皮层神经元,这些细胞显示出基因型依赖性的疾病相关表型。Nature发布CRISPR/Cas9系统应用新突破
另外哈佛大学的David Liu等人则采用了其它的方法解决编辑效率低的问题——他们构建出了一种新型的“碱基编辑器”,能够在人类和小鼠细胞系中以低出错率永久及高效地将胞嘧啶(C)转换为尿嘧啶(U)碱基。
在这一系统中,研究人员改造了Cas9酶,使它不再能够切割DNA;然后将其与另一种能够将一种碱基(胞嘧啶,C)转变为另一种碱基(尿嘧啶,U)的酶APOBEC1绑定在一起。U通常存在于RNA中,在DNA中细胞会把它当作T来阅读。在这样一个系统中,导向RNA将经改造的Cas9送到基因组中的目标位置,系统中的另一种酶(碱基修饰酶APOBEC1)发挥改变DNA序列的作用,而不是去切断它们。
在人类细胞的6个位点利用这一技术,研究小组报告称靶向碱基修正率达到37%,只有大约1%的序列显示核苷酸插入或缺失。相比之下,在其中三个位点测试标准Cas9编辑技术,显示不到1%的效率,且有4%以上的核苷酸插入或缺失。而且这一组研究人员还通过在小鼠细胞中将与阿尔茨海默病相关的APOE基因的一个变体转变为低风险的版本,纠正了疾病相关的突变。
此外,近期宏基因组学、生物信息学和微生物学研究领域的进展也帮助科学家们识别和了解了不同原核防御系统中新型核酸酶,如张锋研究组此前曾发现了自然存在的、具有基因组编辑潜力的三个新蛋白:C2c1、C2c2和C2c3,他们探究了这些蛋白质的功能,揭示出它们与已充分确定特征、广泛用于基因组编辑的Cas9蛋白大不相同,而且研究小组还推断出了这些适应性防御系统复杂的进化途经。这些系统有望进一步扩大基因组编辑工具箱。
CRISPR-Cpf1系统也是其中这一,这一系统于2015年最新发现,其具有一些不同于Cas9的特点,如在它的自然形态下,DNA切割酶Cas9与两条小RNAs形成了一种复合物,两条RNAs均是获得切割活性的必要条件。Cpf1系统更简单一些,它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小,使得它更易于传送至细胞和组织内。
还有Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时,它切割的是同一位点的两条链,留下的“平端”(blunt ends)在重新连接时往往会发生突变。采用Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的,在裸露端留下了短悬端(overhang)。这预计有助于精确插入,使得研究人员能够更有效及精确地整合一段DNA。
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还有中国科学家利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute来实现DNA引导的基因组编辑。河北科技大学Nature子刊:替代Cas9的基因组编辑新技术
这一技术被称为 NgAgo,特点为:1.向导设计制作简便:可以像合成PCR引物一样合成短链单链DNA向导;向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体。2.可编辑基因组内任何位置:Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制。而NgAgo对靶点选择没有限制,对基因组任何位置都能有效引入双链断裂。3.由于向导核酸是DNA而非RNA,因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应。4.对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。这种新技术也许能将基因编辑的可能性推入更广泛领域。
总而言之,虽然基因组编辑的美好前景已经点燃了几乎所有生物学领域,但是一些实验依然受阻缺乏有效的工具。通过改进Cas9,寻找新的酶,也许研究人员能利用升级版基因组编辑工具,加速基础研究和临床应用。
(生物通:张迪)
注;
非同源末端连接
非同源末端连接(Non-homologous End
Joining-NHEJ)是真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下,而为了避免DNA或染色体断裂(Breaks)的滞留,避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响,强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。
参考文献:
Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities
In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9
High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects
Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity.
Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage
Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems
The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA
Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system
DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute
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