两位CRISPR领衔科学家探讨CRISPR遗传筛选

　　自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因编辑之后，这个前途光明的技术已经被应用到了许多研究领域，而且随着技术的改良，越来越多的研究团队利用CRISPR进行大规模的遗传筛选，两位该领域领衔科学家近期特别介绍了这方面的新进展。

　　

生物通报道：基因编辑，尤其是CRISPR/Cas9系统，从某种意义上来说就像是一辆正在生产的闪亮新车，在构建主要框架的同时也开始启动，而且还准备开始一路飚车。

自2012年底CRISPR/Cas9最初被用于基因编辑之后，这个前途光明的技术已经被应用到了许多研究领域，而且随着技术的改良，越来越多的研究团队利用CRISPR进行大规模的遗传筛选，比如用于识别导致癌症抵抗治疗的突变，或者加速药物靶标评估。RNA干扰，相比于CRISPR/Cas9 在遗传筛选方面的作用，无论是效率和特异性方面，目前都难以望其项背了。

同时，譬如MD安德森癌症中心等处的研究人员也开始进一步了解CRISPR/Cas9的特性和局限性，了解它到底能做些什么，比如分析人类细胞系。CRISPR/Cas9 工具箱不断的扩大，Broad研究院的张锋等人也开始利用Cas9结合到基因组上，停止或者加强转录。他们对于CRISPR/Cas9在遗传筛选方面的作用，有何看法呢？

张锋

Broad研究院核心成员
哈佛Keck职业发展教授

张锋研究组曾在“Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity”这篇文章中，探讨了从化脓性链球菌中改变了组成Cas9酶的1400个氨基酸中的3个氨基酸，从而将基因编辑中脱靶效应降低到了几乎无法检测的水平的可能性。当RNA 与DNA 不是那么配对的时候，Cas9内切酶会诱导脱靶突变，导致这无法成为临床试验中的精确基因编辑。

为了能容纳下Cas9蛋白，DNA链需要分开，张锋研究组进行了结构分析，发现在Cas9蛋白位点的负电荷非靶标DNA上有一个合适的正电荷凹槽。“我们认为如果能中和部分正电荷，就能消弱稳定性，从而 令Cas9更具特异性，”张锋说。

他们利用已知定位在特殊脱靶位点上的导向RNAs来进行了这个方法的实验，研究组构建出了Cas9的32个单突变，然后将每个突变通过EMX1基因有效，但容易出现错误的导向RNA，靶向EMX1。

结果发现其中五个能完成EMX1基因的基因编辑，但能减少脱靶位点切割十倍，之后研究人员又尝试利用Cas9突变去切断另外一个基因：VEGFA，这种基因已知能在两个之前识别的脱靶位点上进行切割。虽然所有的Cas9突变都减少了脱靶效应，但是研究人员认为他们应该结合这些突变，让Cas9更 具特异性。因此他们利用三点突变体（triple-point mutations）产生了两个不同的突变，发现“我们能完成靶向激活，并进一步减少脱靶活性，”张锋说。

张锋将这些增强版的特异性Cas9蛋白称为“eSpCas9 突变”，研究组成员用一个三点突变和一点突变eSpCas9检验了许多导向RNAs，从中发现这两者在编辑靶向位点时具有相似的效率，不过一些突变与不同导向RNAs配对使用会出现一些效率的差别。“平均来说，这些突变和野生型Cas9效率差不多，”张锋说。

此外，研究组也结合野生型 Cas9组合进行了多种导向RNAs突变的尝试，结果在导向RNAs的3'末端（特异性导向处）发现有一种所谓“种子区域”（seed region，生物通译）。相反，新的eSpCas9 变种会将这一区域延伸到整个导向RNAs，而这也会令这一系统更加特异性。

如何利用CRISPR发现未知基因功能

CRISPR 系统的一大亮点在于导向RNAs的特异性，张锋说，这样一来我们就能生成靶向每个基因或某个基因多个位点的CRISPR导向慢病毒库。然后再转导进入细胞系，获得单个基因或被激活，或被失活的细胞池。

2014年，2015年张锋研究组陆续发表了相关的不少文章，如其研究组曾构建了靶向18,080个基因（64,751个独特靶向序列）的全基因组范围CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库慢病毒库，用于进行在人类细胞中的正向和负向选择性筛选。之后这个研究组还建立了70,290个导向RNA的文库，来靶标人类基因组超过两万个基因，由此鉴定出了让黑色素瘤抵抗药物PLX-4720的基因。PLX-4720对于携带BRAF突变的患者疗效比较好，残存下来的癌细胞会长成新的肿瘤，导致癌症复发。

BRAF V600E 是一个著名的致癌突变，美国FDA曾批准的抗癌药Zelboraf（vemurafenib，罗氏）就是靶向这个突变，但是随着细胞快速突变，一些患者在第24周治疗时出现了抗性，肿瘤复发。

“这也许是一个机会，我们可以利用全基因组文库检测哪些基因在打开或者关闭的时候，导致肿瘤细胞对vemurafenib产生了抗性，”张锋说。

这种CRISPR 基因敲除文库采用了能靶向基因组中所有保守编码外显子的导向指引，“在设计这些多条件筛选实验的时候，我们用的都是多个导向，确保出现一些冗余，能告诉了我们任何单个导向的效率并不是由于脱靶修饰 导致，”他补充道。研究组也尝试验证了他们的这些新候选，将研究结果与之前的RNAi筛选进行比对，结果发现能找到几个vemurafenib抗性的top hits，而RNAi筛选只能找到一个。

张锋研究组研发的功能获得突变 CRISPR 筛选系统也帮助完成了vemurafenib抗性研究，他将这个新型CRISPR激活基因筛选工具称为SAM，也就是协同激活调控子（synergistic activation mediator，生物通译），利用这一系统，其研究组激活了12个不同的基因，这些基因如果采用之前的方法很难进行开启，“而且之前系统中许多基因实际上都无法真正激活，这一新系统能百倍，或者千倍的激活转录，”张锋说。

张锋实验室目前尝试通过识别基因编辑更多有用的酶，进一步扩增 CRISPR 编辑工具箱。比如去年秋天他们发现了Cpf1，这是具有不同剪切活性的DNA内切酶，能用于某些情况。新Cpf1系统也具有一些不同于Cas9的地方：

1.在它的自然形态下，DNA切割酶Cas9与两条小RNAs形成了一种复合物，两条RNAs均是获得切割活性的必要条件。Cpf1系统更简单一些，它只需要一条RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小，使得它更易于传送至细胞和组织内。

2.且有可能最重要的是，Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。当Cas9复合物切割DNA时，它切割的是同一位点的两条链，留下的“平端”（blunt ends）在重新连接时往往会发生突变。采用Cpf1复合物生成的两条链切口是偏移的，在裸露端留下了短悬端（overhang）。这预计有助于精确插入，使得研究人员能够更有效及精确地整合一段DNA。

3.Cpf1切口远离识别位点，这意味着即便在切割位点靶基因突变，仍然可以进行再度切割，提供了多次机会来校正编辑。

4.Cpf1系统为选择靶位点提供了新的灵活性。像Cas9一样，Cpf1复合物必须首选附着PAM,短序列，选择的靶点靠近自然存在的PAM序列。Cpf1系统识别的PAM序列与Cas9截然不同。这在靶向某些基因组如疟原虫及人类基因组时可能是个优势。

此外，研究组还发现了其它CRISPR/Cas系统 C2c1, C2c2 and C2c3，目前他们正在研究其作用机制。

Traver Hart

MD Anderson癌症中心生物信息学与计算生物学副教授

 
以RNA干扰为基础的遗传筛选已经实现了人类细胞全基因组范围筛选，但是由于对 RNAi 生物学的不完整解析，以及由此产生的数据，导致了一些错误的分析，比如一篇2012年发表在Science杂志上的文章：Use and Abuse of RNAi to Study Mammalian Gene Function 就指出了这些问题，并认为研究哺乳动物基因功能需要更加精确复杂的方法。

2013年，Science接连发表了两篇人类细胞CRISPR-Cas9敲除筛选研究成果，一篇发现靶向18,080个基因（64,751个独特靶向序列）的全基因组范围CRISPR-Cas9敲除（GeCKO）文库慢病毒传递，能进行在人类细胞中的正向和负向选择性筛选；另外一篇通过CRISPR技术，鉴定出允许黑色素瘤细胞增殖的基因和让它们对某些化疗药物产生耐受性的基因。

RNAi 的不足之处在于它靶向 mRNA 而不是 DNA，因此它不可 能100% 剔除基因。张锋之前曾表示，“CRISPR 能够完全地剔除细胞中的一种给定蛋白，而shRNA(短发夹RNA) 只是降低它的表达水平，但是从不会达到完全剔除。”

来自加拿大多伦多大学Jason Moffat实验室的Traver Hart也是一位CRISPR技术领域的青年科学家，他曾自己定义了一套用于评估RNAi和CRISPR遗传筛选治疗的金标准，并且利用HCT116细胞系（来自人类结肠癌），Hart发现CRISPR筛选不仅更加敏感，也能避免出现额外的背景错误。

相比于RNAi筛选，CRISPR筛选具有哪些优势呢？CRISPR 筛选是通过“整个生物学意义基因表达（水平）进行筛选，而shRNA似乎只能在非常高水平表达的基因中进行筛选，”Hart说，“这些信息我们无法从shRNA数据中获取，除非我们能更好比对它，所以我们无法得知那些不知道的信息，而CRISPR技术，我们确信它将会革新遗传筛选领域。”

Hart研究组去年发表文章，逐个关闭了近1.8万个基因（整个人类基因组的90%）来寻找对细胞生存至关重要的基因。由此Hart生成了多伦多敲除文库（Toronto KnockOut (TKO) library），靶向17,661个人类蛋白编码基因的慢病毒编码导向RNAs二代文库。Hart说，“这个数字对于任何进行shRNA或者RNAi研究的人来说都十分惊人（后者一般只能获取几百个数据）”。

12年前的人类基因组测序让科学家们编写出了构成我们细胞和身体的部件——我们2万个基因的清单。尽管取得了这一重大的成果，我们仍然不清楚每个基因的功能，或当一些基因出错时让我们生病的机制。为了做到这一点，科学家们意识到必须要逐个去关闭整个基因组中的基因，以确定细胞中哪些过程出现了错误。但可以利用的工具不是不准确就是太慢。

CRISPR的出现使得快速及高精度关闭基因变为可能，而且这项研究也通过在5种不同的癌细胞系，包括脑癌、视网膜癌、卵巢癌和2种大肠癌细胞中关闭一些基因，发现了每种肿瘤都依赖于一组独特的基因，可以用一些特异性药物来靶向它们。这一研究发现为设计出只靶向癌细胞，而不损伤周围健康组织的新疗法带来了希望。

最初Hart等人只是想弄清楚不同细胞系或遗传背景下需要什么不同的基因，了解细胞系的基因型有助于他们进行预测，例如结肠癌，携带DLD1 和 HCT116 的细胞系都存在 KRAS 驱动突变，这表明 MAPK 下游通路都被激活了，Hart等人通过筛选证实了这一预测。

为了更好地理解每个细胞系中特有的易感性，Hart去除了核心元件，对剩下的特异性元件进行了功能检测，从中发现了一个最佳适应过程独特标志，他说。

这些研究带来了一些令人惊讶的发现：具有相似遗传谱的细胞系，其适应度却不尽相同，比如 DLD1 和 HCT116 都携带致癌的 KRAS 突变，但表皮生长因子受体（与包括结肠癌在内的许多癌症有关的细胞表面受体）基因，以及其分子伴侣却只在DLD1细胞系中击中（hit）。

在一项尚未发表的单独研究中，Hart研究组完成了HPAF-II 胰腺癌细胞筛选，此次遗传筛选发现了许多参与细胞增殖的辅助进程，例如翻译后修饰，受体内吞作用。

此外，此次筛选也指定了一些特殊的受体家族成员：卷曲受体（Frizzled receptor）家族成员，Wnt配体成员，“我们不仅了解了细胞系中野生型生长通路和进程的宽度，而且也非常详尽的分析潜在可行的靶标，”他说。

癌细胞系中核心必需基因也可以作为治疗靶标进行研究，2012年，Dana-farber 癌症研究所的研究人员发现当肿瘤抑制基因丢失时，附近的几种并不在癌症形成中起作用的基因也同样丢失，这也支持了20多年前提出的一个理论，即阻断其中一些邻近基因的剩余拷贝可能对癌细胞是致命的。

这组研究人员分析了来自广泛多样的超过3100个样本的拷贝数图谱，发现大部分显示的拷贝数丧失影响了至少11%，多达40%的基因组。许多受到影响的基因由于“乘客”事件或由于它们接近频繁缺失的肿瘤抑制基因而反复丢失。这一理论后来被命名为“附带致死”，Hart等人在2015年的一篇综述中介绍了这一理论。

Hart表示，删去某个抑癌基因附近的核心必需基因也许为癌症治疗打开了一扇新的窗，例如 POLR2A 就是编码RNA聚合酶亚基的一个必需基因，这个基因的一个拷贝总是会在卵巢癌中随着明星抑癌基因TP53被附带删除掉。去年卢雄斌（Xiongbin Lu）博士研究组找到了一种基于α-amanitin的抗体药物偶联剂（antibody drug conjugates，ADCs），在小鼠研究中证实以POLR2A基因作为靶向目标的ADCs可以高效地治疗大肠癌。这种药物可以让肿瘤完全消退，且毒性大大减小。ADCs提高了对癌细胞的靶向作用，且对健康细胞的影响很小。

随着越来越多的研究人员开展CRISPR筛选研究，核心必需基因库也会随着增长，Hart说，“它们分散在基因组中，当肿瘤中特殊拷贝丢失出现，它们中的一个也许就能成为治疗靶标。这是一个非常令人激动的癌症研究领域，不仅特异性强，而且核心元件也是潜在的治疗靶点。”

（生物通：张迪）

参考文献：

Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells

Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex

A genome-scale RNA interference screen implicates NF1 loss in resistance to RAF inhibition

Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system

Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems

Cancer vulnerabilities unveiled by genomic loss

Collateral Lethality: A New Therapeutic Strategy in Oncology

TP53 loss creates therapeutic vulnerability in colorectal cancer

Use and Abuse of RNAi to Study Mammalian Gene Function

Measuring error rates in genomic perturbation screens: gold standards for human functional genomics

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells

Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system

High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities