中大****发表CRISPR成果

　　目前还没有开发出一种方便而无偏差的方法，能够确定蛋白质稳定性的调节因子。近期，来自中山大学肿瘤防治中心的研究人员，在《Cell Discovery》杂志发表的一项研究中，通过将全基因组CRISPR-Cas9文库与双荧光蛋白稳定性报告基因以及高通量测序相结合，开发出了一种蛋白质稳定性调节因子筛选试验（Pro-SRSA）。

　　

生物通报道：在细胞中，对于不稳定的蛋白质来说，稳定性调控是特别重要的。然而，目前还没有开发出一种方便而无偏差的方法，能够确定蛋白质稳定性的调节因子。近期，来自中山大学肿瘤防治中心的研究人员，在《Cell Discovery》杂志发表的一项研究中，通过将全基因组CRISPR-Cas9文库与双荧光蛋白稳定性报告基因以及高通量测序相结合，开发出了一种蛋白质稳定性调节因子筛选试验（Pro-SRSA）。

本文通讯作者康铁邦博士，是中山大学肿瘤防治中心/华南肿瘤学国家重点实验室PI、国家杰出青年基金获得者。康博士于2003年获德国Bielefeld大学生物化学博士学位，1998年至2008年一直在美国、德国从事细胞生物学研究工作。2008年5月，全职回国（中山大学“****”引进人才）；2009年，获得国家自然科学基金重点项目、“973”计划项目（课题组组长）；2011年，获得国家杰出青年基金、“973”计划项目（学术骨干）；2012年，获得国家肝癌重大专项基金（子课题）。长期从事细胞生物学的研究工作，主要研究方向：细胞周期调控、肿瘤靶向治疗和个体化治疗的基础研究、肿瘤的转移调控等。在SCI杂志发表论著48篇，通讯或第一作者在Cancer Cell, J. Clin. Invest., J. Natl. Cancer Inst., Cancer Res., J. Biol. Chem., Cell Res., Oncogene, FASEB J. 等国际主流杂志上发表论著17篇。延伸阅读：中大****发表肿瘤研究新成果。

在多种生理条件下，可调节的蛋白质降解在细胞周期进程、细胞的生长、分化和信号转导中起着至关重要的作用。一些与癌症相关的蛋白质的降解异常，可能导致细胞的转化，而许多其他蛋白的失调与其他疾病相关。因此，了解蛋白质降解的精确调控，对于了解生物机制，以及为疾病开发治疗性干预措施，都是一个重要的问题。然而，因为缺乏一种有效的方法，公正和全面地描述一个蛋白质内稳态的调节因子，仍然具有挑战性。

到目前为止，有多种方法可以用于确定哺乳动物细胞中蛋白质稳定性的关键调节因子，然而每种方法都有明显的缺点。最近出现了一种基于荧光的系统，可在单细胞水平上监测蛋白质动态。在不同的技术当中，总体蛋白质稳定性（GPS）分析和蛋白质周转试验（ProTA）已被证明发挥很好的作用。在这两种方法都是基于双荧光，一个与感兴趣的蛋白质融合，另一个作为参考。

最近，有几个研究小组表明，CRISPR-Cas9文库是开展全基因组功能缺失筛选的一种简单有效的系统。与mRNA的短发夹RNA相比，CRISPR-Cas9将插入缺失突变引入基因组DNA中，以介导基因敲除。因此，纯合基因敲除赋予了筛选很高的灵敏度，而不完整的敲除则保留基因功能。

在这项研究中，研究人员开发了一种蛋白质稳定性调节因子筛选试验（Pro-SRSA），将全基因组CRISPR-Cas9文库与双荧光为基础的蛋白质稳定性报告基因以及高通量测序结合起来，筛选蛋白质稳定性的调节因子。使用Cdc25A作为例子，Cul4B-DDB1DCAF8被确定为Cdc25A的一个新E3连接酶。此外，Cdc25A在赖氨酸150上的乙酰化作用——是由p300/CBP乙酰化和由HDAC3去乙酰化，可阻止泛素蛋白介导的Cdc25A降解。

这项研究首次报道，乙酰化——作为一种新的翻译后修饰，可调节Cdc25A稳定性，研究人员认为这种无偏差的全基因组CRISPR-Cas9筛选方法，可能广泛用来全面确定蛋白质稳定性的调节因子。

（生物通：王英）

生物通推荐原文摘要：
A genome-scale CRISPR-Cas9 screening method for protein stability reveals novel regulators of Cdc25A
Abstract：The regulation of stability is particularly crucial for unstable proteins in cells. However, a convenient and unbiased method of identifying regulators of protein stability remains to be developed. Recently, a genome-scale CRISPR-Cas9 library has been established as a genetic tool to mediate loss-of-function screening. Here, we developed a protein stability regulators screening assay (Pro-SRSA) by combining the whole-genome CRISPR-Cas9 library with a dual-fluorescence-based protein stability reporter and high-throughput sequencing to screen for regulators of protein stability. Using Cdc25A as an example, Cul4B-DDB1DCAF8 was identified as a new E3 ligase for Cdc25A. Moreover, the acetylation of Cdc25A at lysine 150, which was acetylated by p300/CBP and deacetylated by HDAC3, prevented the ubiquitin-mediated degradation of Cdc25A by the proteasome. This is the first study to report that acetylation, as a novel posttranslational modification, modulates Cdc25A stability, and we suggest that this unbiased CRISPR-Cas9 screening method at the genome scale may be widely used to globally identify regulators of protein stability.