如何在癌症研究中使用CRISPR工具

　　2016年6月21日，对CRISPR技术而言是具有里程碑意义的。这一天，美国NIH的重组DNA顾问委员会给美国的第一例临床试验开了绿灯。研究人员计划用CRISPR/Cas9技术来增强癌症疗法。如果你也希望在自己的实验室中开展此类研究，那么你应该感到幸运，市场上的工具在不断涌现，且功能也很强大。

　　

2016年6月21日，对CRISPR技术而言是具有里程碑意义的。这一天，美国NIH的重组DNA顾问委员会给美国的第一例临床试验开了绿灯。研究人员计划用CRISPR/Cas9技术来增强癌症疗法。这距离它的发现，仅仅只有四年。

Horizon Discovery的首席科学家Jon Moore认为，基因组编辑在药物靶点的鉴定和验证以及直接的细胞治疗上具有重要的意义。例如，Horizon已经启动了一项混合文库筛选，寻找与抑癌基因p53相互作用的基因。他们鉴定出MDM2，作为另一种潜在的药物靶点。“那些保留了野生型p53活性的癌细胞对MDM2的敲除十分敏感，”Moore说。

如果你也希望在自己的实验室中开展此类研究，那么你应该感到幸运，市场上的工具在不断涌现，且功能也很强大。

gRNA文库

对于希望在抗癌研究中使用CRISPR的人们来说，最有用的工具之一是向导RNA文库。这些文库通常有两种形式。芯片是将文库分配到一块或多块微滴定板的各个孔中，每孔包含针对单个基因的游离gRNA。筛选条件取决于特定的应用，但这种文库可以鉴定出增强肿瘤耐药性的基因。

赛默飞世尔的Invitrogen™ LentiArray™文库就是慢病毒文库芯片，针对每个基因有四个gRNA。据该公司的研发主管Jon Chesnut介绍，他们致力于研究整个人类基因，但目前只有针对人类激酶组和GPCR的集合。

默克旗下的Sigma-Aldrich与Wellcome Trust Sanger研究院也合作开发出一款Sanger Human Whole Genome Arrayed Lentiviral CRISPR文库。它大约包含40,000个gRNA，针对人类和小鼠的每个基因有两个gRNA。

在混合文库中，所有用于筛选的gRNA都混合在单个管中。之后，用这个混合物来转导细胞，其中每个细胞都挑选一个表达载体。将细胞进行阳性或阴性选择，如药物处理，并测序存活细胞，研究人员可确定哪些gRNA是最有效的。

混合文库可从GE生命科学/ Dharmacon、默克/Sigma-Aldrich及安捷伦科技等公司购得。安捷伦在2月推出了一个文库的早期试用计划，它是基于Broad研究院的GeCKO v2慢病毒文库，总共包含123,411个向导RNA。这家公司也提供定制文库，最多提供20万个自行设计的gRNA。

Sigma-Aldrich也开发一种gRNA文库，专门用于它的dCas9-p300激活物载体。这个文库可上调目标基因的表达，而不是敲除或修复基因。据基因编辑开发部门的主管Patrick Sullivan介绍，这种文库可鉴定哪个基因的激活能让治疗更有效，或确定新的成药靶点。它预计在2017年推出。

详细了解赛默飞世尔的Invitrogen LentiArray 文库

CRISPR的导入

对于那些设计CRISPR实验的研究人员，Takara Bio欧洲的技术支持专家Cornelia Hampe提出了两方面的建议。首先，考虑到脱靶效应的可能性，每个目标应当设计多个向导RNA，大概四至五个。最好利用多个工具来设计它们，并在体外进行检验，之后才用到细胞上。她的第二个建议是控制Cas9表达的强度和持续时间，特别是在开发治疗剂时。

“在大多数情况下，如果是非常强的稳定表达，则有可能导致脱靶效应，”她说。“作为治疗剂，你需要确保脱靶效应尽可能地低。”

如何实现这一点？尽管研究人员有多种选择来导入Cas9和gRNA，包括DNA质粒表达、病毒载体、体外转录系统和纯化的mRNA，甚至是完整的核糖核蛋白复合物，但大多数专家表示，有经验的人选择瞬时导入。

“此时最流行也最有效的Cas9形式是纯化的蛋白或纯化的RNA，”Chesnut谈道。对于前者，研究人员将纯化的Cas9和体外转录的RNA混合，通过电穿孔或利用专门的试剂（如赛默飞世尔的Lipofectamine™ CRISPRMAX™）导入细胞。

另一个选择是Takara的“gesicle”（糖蛋白囊泡）技术。据Hampe介绍，gesicle是布满糖蛋白的纳米颗粒。经过专门的包装细胞系的包装，这些颗粒具有广泛的细胞趋向性，可导入分裂和非分裂细胞。它们拥有红色荧光蛋白标志物，可照亮感染的细胞。此外，它们在快速编辑后快速清除。

类器官培养

另一个基于CRISPR的癌症研究工具是3D细胞培养，又称类器官培养。根据最新的一篇综述，类器官是来源于原代组织、ESC或iPSC的体外3D细胞簇，具有自我更新和自我组织的能力，并且表现出与来源组织相似的功能。

有了类器官和CRISPR，研究人员能够在正常细胞中引入突变，或者校正癌细胞中的突变，然后监控细胞的增殖能力或药物反应，以及它们的转录组或蛋白表达图谱。

在最近的一项研究中，荷兰Hubrecht研究所的研究人员利用CRISPR基因编辑，在人类野生型肠道上皮细胞类器官中引入四个与结肠直肠癌相关的突变。之后，培养物表现出染色体不稳定性，当注射到免疫缺陷型小鼠之后形成肿瘤，这表明它们代表了结肠癌的一个真实模型。

也许，这些工具在几年之后才能真正地步入临床。不过，考虑到CRISPR研究的速度，可以肯定地说，新工具还将不断涌现。

（作者：Jeffrey M. Perkel / 生物通编译）