清华大学最新文章：突破浓度限制的单分子FRET成像新方法

　　论文报道了利用光激活的荧光团代替传统荧光团，以突破全内反射荧光显微技术中的荧光浓度屏障的通用方法，实现将标记物种的最高浓度限值提高2-3个数量级，从而可以在接近生理条件的μM浓度下进行单分子FRET测量。

　　

2017年5月11日，清华大学生命科学学院陈春来研究组在《Angewandte Chemie》（德国应用化学）杂志在线发表题为 “Single molecule photoactivation FRET, a general and easy-to-implement approach to break the concentration barrier”的研究论文。该论文报道了利用光激活的荧光团代替传统荧光团，以突破全内反射荧光显微技术中的荧光浓度屏障的通用方法，实现将标记物种的最高浓度限值提高2-3个数量级，从而可以在接近生理条件的μM浓度下进行单分子FRET测量。

单分子荧光技术可以在复杂体系内实时观测生物分子的动态过程，并揭示隐藏在传统系综平均测量中的重要信息，包括生物分子之间的差异性以及反应过程中的瞬时中间态等。基于全内反射荧光显微镜的单分子荧光共振能量转移技术（FRET）已经被广泛应用于研究生物大分子的自身构型变化和分子间相互作用等动态过程。然而，基于全内反射荧光显微镜的单分子FRET技术仍然存在着缺陷和不足。全内反射荧光显微镜中最高可使用的荧光标记样品浓度——既荧光浓度屏障——在50 nM左右，这远远低于许多生化反应的结合常数，也远低于许多生物分子在生理条件下的浓度（μM量级）。

图1：光激活单分子FRET（sm-PAFRET）的原理示意图。

在论文中，基于光激活染料，提出了sm-PAFRET的新方法（图1）。利用激活光源（紫色）将玻片表面附近的光激活荧光团（黑色）都转变为可发射荧光的激活态（绿色）。待激活光源关闭后，在溶液中自由扩散的激活态荧光团会快速的扩散离开玻片表面，而只有固定或与表面的生物大分子反应的激活态荧光团标记分子才会被随后照明的激发光源（绿色）激发产生荧光。通过激活和激发光源的交替照明，可以不断的激活在实验观测过程中结合到表面的荧光团，并测量其单分子FRET，实现在高浓度的荧光标记物种的条件下，进行基于全内反射荧光显微镜的单分子FRET实验。

这项研究将这一新方法应用于核糖体的翻译延伸过程中，随着tRNA浓度的增高，tRNA进入核糖体的速率越快。延伸因子G（EF-G）的浓度增高，tRNA与EF-G 之间FRET的停留时间减慢，捕捉到核糖体pre-translocation复合体的形成后的一些瞬时的中间状态。该方法实现了将标记物种的最高浓度限值提高2-3个数量级，在接近生理浓度下的单分子实验有望揭示更多未知的分子机制。

清华大学生命科学学院研究员陈春来为本文的通讯作者，清华大学生命科学学院2015级直博生彭思佳为本文的第一作者。本工作得到了清华大学-北京大学生命科学联合中心、清华大学结构生物学高精尖创新中心、国家自然科学基金委等的经费支持。