CRISPR大范围意外“脱靶”引发的激烈讨论

　　近日来，有关5月30日《Nature Methods》报道的“Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo”文章的专业讨论浮出水面，当人们从最初的震惊中冷静下来后，越来越多的人给出了趋于理性的意见。

　　

来自西班牙国家生物技术中心、擅长使用CRISPR小鼠基因编辑技术的Lluis Montoliu说：“他们（指原文作者）使用了并不常用的方法。”他认为，作者在注射CRISPR治疗中所使用的并非最优的分子组合，其中一个质粒容易造成细胞产生过量的Cas9酶，造成他们所看到的严重的脱靶效应。

 

澳大利亚国立大学JCSMR致力于细胞环境对CRISPR的效率影响研究的遗传学家Gaétan Burgio认为，本文中所提到的惊人数量的脱靶突变并不属实。自2014年以来，Burgio一直在用CRISPR对小鼠DNA进行编辑，从未见过类似水平的脱靶突变。他说，他相信其他研究将驳斥这篇文章的发现。
 

Burgio说，造成老鼠有这么多意想不到的变化的原因很多，包括检测DNA变异的准确性问题，老鼠样本量太少。作者也没说清楚这是CRISPR的问题还是Cas9起作用后的随机事件。

在NCBI PubMed评论区，我们看到一位华人学者的笔评：文章补充资料中所列的位于前10位的脱靶位点的序列都写错了，在基因中根本找不到它们，通过仔细比对发现被归为“脱靶”的pde6b基因结果却是本来要“打靶”的基因；文中提到的位于第“11”号染色体的herc1基因，本来是位于第“9”号染色体。在如此高影响力的杂志上发表，Xiaolin Wu不相信这些错误统统都是“笔误”，退一步讲，如果连基本的基因信息都能写错的话，这项研究的“可参考性”让人怀疑。

 
另外，文中主要的一个观点是使用WGS（全基因组测序）来筛选基因突变。但是碱基序列都能写错的话，不得不让人怀疑作者是不是使用了错误的打靶序列。（2015年Nature Method另一篇名为“Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice”也使用了WGS来证明。）

两只老鼠的同源缺失率如此之高，是不是在做数据处理的时候混淆了样品/老鼠。即使其中部分突变或indel可能是真实的，但也可能与CRISPR-Cas9无关。例如，Xiaolin Wu指出两只老鼠都出现了Pde9a基因缺失，但是，作者似乎并不知道Pde9a和pde6b是旁系同源基因（paralogues），如果在胚胎发育时期，就产生了突变和强烈的选择补偿，很可能不是CRISPR-Cas9的脱靶作用。与之相似的情况其实很好检查，可以在体外用数量较大的细胞做一个验证，看看同样的情况是否会一直出现。但是，作者不应该直接声称这些突变是由CRISPR-Cas9造成的。

“是酶的有效性作用还是怎么着，这事儿很值得怀疑，”麻省理工学院基因表达和遗传病领域博后Matthew Taliaferro评论。

 
CRISPR系统的Cas9酶是剪切DNA的执行者。通常异常的高水平酶活容易导致脱靶突变。许多实验室都会使用略有不同的方法，改变Cas9酶结构来消减这种情况的发生，确保只在预期的部位剪切，降低与DNA的非特异性作用。

虽然这篇文章在科学界引发了一场“危机”，但是它所阐述的问题并非一个新问题。

几年前研究学者们就知道CRISPR存在脱靶问题，因此制定了一系列CRISPR操作规则，并且通过优化Cas9的表型使其更加精确，目前人类组织的基因编辑的准确度已得到改善。专注于方法上的改进，使动物基因突变的定位更加有效。科学家们继续磨练基因编辑技术的同时，并没有忘记CRISPR用于人类基因治疗的路还有很长。

这篇文章有益的提示是应从全基因组的角度去探讨CRISPR对活体动物的整体影响来考虑其安全性，特别是医学应用前景。毕竟，“蝴蝶的翅膀也可能扇动风暴”，CRISPR技术所带来的未知效应也许比现在所已知的更多。

但是更理性得看待一篇文章，全面仔细地研究文章内容分析其合理性，而不是简单的看看标题结论，是Xiaolin Wu和生物通网友yiqiangcui同学给我们的重要提示。我们十分感谢！

相关文献：
High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases have no detectable off-target mutations
Boston Scientists Tweak CRISPR Scissors For More Precise DNA Cuts
Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice
Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo
CRISPR基因编辑技术是“魔剪”还是“乱箭”？