CRISPR与PacBio测序相结合，深度解析罕见病

　　目前在研究疾病的分子机理时，也许是受到技术的限制，人们的目光主要聚焦在点突变上。然而，最近发表的一项研究表明，重复扩增区域的完整测序对深入了解疾病的基础至关重要。

　　

生物通报道  目前在研究疾病的分子机理时，也许是受到技术的限制，人们的目光主要聚焦在点突变上。然而，最近发表的一项研究表明，重复扩增区域的完整测序对深入了解疾病的基础至关重要。

这项研究由美国帕金森病研究所、休斯敦卫理公会研究所及其他几个机构联合开展。它介绍了如何将CRISPR/Cas9捕获与单分子实时测序（SMRT）技术结合使用，从而以单碱基的分辨率检测重复区域，且不存在任何PCR偏好。

此次研究的对象是一个墨西哥家庭，其中多个成员带有ATXN10扩增。四名成员表现出10型脊髓小脑共济失调（SCA10）的临床特征。另一名成员还表现出早发性左旋多巴反应性帕金森综合征。然而，一名成员虽携带了大量的ATXN10重复扩增，但临床上没有表现。

脊髓小脑共济失调（SCA）是一种临床上和遗传上异质性的神经退行性疾病，以小脑共济失调为主，但常常伴随着多种神经系统症状。如今已经确定，这些疾病是由重复扩增引起的。重复扩增的长度可能对发病年龄、严重程度或疾病进展有影响。

之前的研究表明，22号染色体上ATXN10基因中ATTCT五核苷酸的扩增是SCA10的起因。正常的重复范围在10-32个ATTCT。若重复次数在280-850，则疾病的外显率较低；若重复次数达到850-4500，则疾病完全外显。到目前为止，尚未有33-279次重复的报道。

为了从遗传上鉴定ATXN10重复扩增，并更好地了解进行性小脑共济失调与癫痫发作和帕金森综合征的表型差异，研究人员采用几种先进的分子遗传技术来解析这个家族中重复扩增的遗传结构。

他们的新方法是将CRISPR/Cas9系统的核酸内切酶活性与PacBio的SMRT测序技术相结合。研究团队报告称，他们能利用这种方法来剪掉ATXN10的重复扩增区域，其中一些的长度达到7 kb，然后将其作为一个连续的片段进行测序，而无需预先扩增基因组DNA。

六名家庭成员的测序结果表明，最严重的家庭成员存在480次ATTCT重复，接着是约920次ATTCC重复中断。另一名患有共济失调和帕金森综合征的家庭成员则存在1300次ATTCT重复，但没有ATTCC重复。“我们认为，重复中断的缺乏也许在疾病过程中发挥作用，导致多巴反应性帕金森综合征的临床表现，”作者写道。

研究人员认为，单分子测序与CRISPR/Cas9捕获的组合方法能够鉴定重复扩增的遗传组成，揭示帕金森病和ATXN10之间表型与基因型的关联。“我们的结论是，ATXN10重复扩增的遗传结构对临床表型的显现至关重要，也许说明了潜在的病理学，”作者写道。（生物通 薄荷）

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原文检索

Parkinson’s disease associated with pure ATXN10 repeat expansion

npj Parkinson's Disease 3, Article number: 27 (2017)
doi:10.1038/s41531-017-0029-x