CRISPR/Cas9基因编辑脱靶效应研究新论文

　　研究揭示在CRISPR/Cas9编辑的棉花植株中，脱靶突变很少更多地是受体材料固有遗传或/和体细胞无性系变异。

　　

华中农业大学棉花团队在Plant Biotechnology Journal上发表了关于基因编辑脱靶效应研究的论文，揭示在CRISPR/Cas9编辑的棉花植株中，脱靶突变很少更多地是受体材料固有遗传或/和体细胞无性系变异。华中农业大学植科院三位博士生李健英、Hakim和孙琳为并列第一作者，金双侠教授为该论文通讯作者。

基因组编辑技术是当前生命科学研究的前沿领域，CRISPR/Cas9系统已用于治愈人类遗传病、实现细胞个性化治疗、开发新药、作物遗传改良等领域。CRISPR/Cas9技术依赖于Cas9核酸酶在gRNA指导下在PAM位点的上游3个碱基的位点切割目标DNA（On-target），但也会切割非靶标的位点（与sgRNA靶标位点序列相似，且具有PAM位点），这就造成所谓的Off-taget（脱靶），从而引起不可控的突变。因此，CRISPR技术存在的脱靶效应（Off-target effect）风险是影响CRISPR技术能否广泛应用的主要限制因素，如何正确评估及降低脱靶效应是当前亟待解决的问题。

关于CRISPR脱靶效应，在动物的基因编辑中已经有比较系统的报道，而关于植物脱靶效应在拟南芥、水稻等二倍体模式植物中有少量报道，几乎没有检测到任何非靶标突变。考虑到这些研究的不足之处，在植物中开展脱靶效应的深度评估，就具有重要的理论和实践意义。

在这篇论文中，研究人员利用高通量测序的方法，详细评估了CRISPR/Cas9 系统在棉花基因编辑过程中的脱靶效应。通过对野生型对照、阴性再生植株、Cas9编辑的阳性植株进行全基因测序，结果证明了CRISPR/Cas9编辑后代中存在数千个SNP/Indels 变异, 这些遗传变异来源于同一亲本的后代个体间的差异或者组织培养过程中的体细胞变异，其数量远远大于CRISPR脱靶位点的数量，结果表明CRISPR/Cas9系统在多倍体植物基因组编辑具有高度特异性、脱靶率极低。

研究人员利用CRISPR/Cas9系统对14个Cas9编辑植株，再加上3 株野生型 和3个再生群体中的阴性单株作为对照进行35×测序深度进行全基因组测序。

研究结果表明，通过比较野生型和阴性对照，每个 Cas9 编辑的单株后代有 4188 ~ 6404 的 SNPs和 312 ~ 745 indels 变异，进一步对这些变异位点的侧翼序列分析，与靶位点没有同源性，绝大多数位点都缺少PAM位点。通过研究可推断出这些变异位点来源于受体材料的不同后代（同一品种不同单株）之间的存在遗传差异以及棉花组织培养过程中的大量存在的体细胞无性系变异。

接下来，在4413个通过软件预测的潜在脱靶位点中仅检测到4个发生了真实的脱靶突变，并用Sanger测序证实。 同时，通过对受体材料JIN668和TM-1参考基因组遗传变异进行分析，检测到61个因为不同材料间的遗传变异可以产生新的脱靶位点，这些结果表明在设计sgRNA时要高度关注转基因母体基因组与参考基因组的遗传变异，利用计算程序减小脱靶风险性。

这篇报道是2017年棉花团队建立高效基因编辑体系基础上的后续系列报道, 这两个研究说明了该团队建立的基因编辑系统，具有极高的编辑效率（平均85%的编辑效率）和高度特异性，完全可以满足棉花功能基因组的研究需求。

原文标题：

Whole genome sequencing reveals rare off-target mutations and considerable inherent genetic or/and somaclonal variations in CRISPR/Cas9-edited cotton plants

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13020