CRISPR技术的前景因免疫反应而蒙上阴影

　　2013年，研究人员首次利用CRISPR-Cas9系统来编辑哺乳动物细胞的基因组，对编辑发生的位置有了很好的控制。从那时起，人们不断提高此系统的效率，创建转基因小鼠模型，并纠正许多遗传疾病。体外和体内的结果都预示着临床上的成功。然而，斯坦福大学的一项新研究给人们泼了一盆冷水，因为人们对Cas9蛋白存在免疫力。

　　

通过基因组编辑来纠正异常，这个概念似乎简单明了。几十年来，科学家也一直尝试用基因编辑来开展治疗，获得了不同程度的成功。最大的障碍来自基因导入系统，它往往使用病毒，具有一定的风险。

2013年，研究人员首次利用CRISPR-Cas9系统来编辑哺乳动物细胞的基因组，对编辑发生的位置有了很好的控制1。从那时起，人们不断提高此系统的效率，创建转基因小鼠模型，并纠正许多遗传疾病。体外和体内的结果都预示着临床上的成功。然而，斯坦福大学的一项新研究给人们泼了一盆冷水，因为人们对Cas9蛋白存在免疫力2。

CRISPR的过去

许多发明都是无心插柳柳成荫，CRISPR-Cas9也不例外。1989年，研究生Francisco Mojica出于好奇，发现耐盐微生物（Haloferax mediterranei）基因组中存在回文重复序列3。这种规律间隔的重复序列不同于任何已知的重复序列家族。

很快，研究人员在更多的微生物中鉴定出这些结构，并将其称之为CRISPR（规律间隔的短回文重复序列）。在噬菌体基因组中观察到重复序列之后，他们提出CRISPR可能有助于微生物抵御噬菌体。2007年，科学家Rodolphe Barrangou和Philippe Horvath发现这是真的。

Barrangou和Horvath的研究表明，细菌基因组容纳部分的噬菌体基因组来作为防御机制，以阻止噬菌体对嗜热链球菌的进一步攻击4。接下来，研究人员一步步阐明CRISPR-Cas9如何在微生物免疫中发挥作用。CRISPR序列基本上来自入侵的噬菌体，保留了对攻击者的记忆。CRISPR序列之后转录称短的向导RNA（gRNA），而gRNA将Cas9核酸酶引导至匹配的噬菌体DNA上。Cas9切割外源DNA，使其失活。

2013年发表的CRISPR-Cas9成果为体外和体内操作基因组引入了一种新方法，激发了人们利用基因疗法来治愈疾病的热情。基因疗法已经出现了很多年，但由于靶向基因导入和宿主免疫反应的种种问题，一直难以实现人们的期望。CRISPR-Cas9有望解决大部分问题，但仍不清楚它在临床上是否有效。

CRISPR的现在

人体的免疫系统相当复杂，尽管开展了大量研究，但研究人员仍然无法准确预测人体对外来或自身抗原、细胞或微生物的免疫反应。一次又一次的治疗失败，免疫系统都是背后主因：移植物抗宿主病、细胞的免疫排斥，病毒载体的严重免疫反应。因此，带有抗体的患者必须被排除在临床试验之外，以避免不良免疫反应，甚至死亡。

斯坦福大学的Matthew Porteus对CRISPR-Cas9在人体中是否可行感到很好奇，因为常用的Cas9蛋白来自金黄色葡萄球菌（S. aureus）和化脓性链球菌（S. pyogenes），对人类来说是病原体。人类似乎拥有针对这些病原体的免疫力。“没有人开展这方面的研究，因此我们决定自己来。我们想看看健康的成年人是否有识别Cas9的抗体。”

一开始，Porteus的团队并没有料到会检测到免疫反应，因为葡萄球菌和链球菌的多个抗原都在表面，而Cas9是细胞内的蛋白。他们采集成年人血液和脐带血，将其与2种不同的Cas9蛋白混合，并评估抗体的存在。

结果让研究人员十分意外。“事实上，70%的健康成年人都携带了两种Cas9的抗体。这让我们大开眼界。然后我们想，抗体属于适应性免疫反应的一部分，那么T细胞又将如何？”Porteus回忆道。

为了研究Cas9蛋白是否会刺激血液中不成熟的T细胞发展为辅助性或杀伤性T细胞，研究人员将含有不成熟T细胞的血液与Cas9蛋白混合。新生儿的免疫系统无法产生免疫反应，但金黄色葡萄球菌的Cas9会诱导成年人血液中的T细胞反应。Porteus认为，这个结果为基因治疗试验抛出了一个危险信号，因为Cas9的使用有可能在临床背景下造成严重的炎症反应和组织死亡。

CRISPR的未来

“现在还为时尚早，”Porteus说。“我们并不认为这意味着这项技术的热度会下降，但我们的确认为，它提出了一个值得考虑的问题。”

在这种情况下，像以往的临床试验那样排除有免疫力的患者是不可行的，Porteus预计大多数群体对Cas9蛋白都存在免疫力。不过，研究人员肯定不会放弃研究工作，力争开发出在临床上有效的基因疗法。

“我认为人们将会做几件事：1) 从不感染人类的其他细菌中获得Cas9系统，2) 研究对金黄色葡萄球菌的免疫反应何时发生，因为此系统适用于儿童，3) 确定蛋白的哪些区域是免疫原性的，”Porteus说。“我认为这是可行的，但也是颇具挑战性的。人体的免疫系统相当尽职。”

Porteus希望，这项工作能够鼓励研究人员在考虑技术有效性的同时，考虑免疫反应。“人体的免疫反应一直为基因治疗带来问题，我认为基因组编辑领域也有必要了解这一点。更好地了解它，将帮助人们找出解决方案，”Porteus说。

参考文献

1. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823.
2. Charlesworth CT, Deshpande PS, Dever PD, Dejene B, Gomez-Ospina N, Mantri S, Pavel-Dinu M, Camarena J, Weinberg KI and Porteus MH. (2018). Identification of pre-exisiting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans. bioRxiv.
3. Mojica, F.J.M., Juez, G., and Rodrı´guez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Mol. Microbiol. 9, 613–621.
4. Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., and Horvath, P. (2007). CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315, 1709–1712.