Science综述：DNA读写和分子记录仪的新兴应用（二）

　　这篇综述文章介绍了一些相关技术进展，概括了它们的前景和触手可及的应用，并讨论了这些技术用于构建处理和记录活细胞内各种信息遗传电路的特征和当前局限性。

　　

文章回顾：Science综述：DNA读写和分子记录仪的新兴应用（一）

2）伪随机DNA编写器

有两种主要类型的伪随机DNA编写器，第一类依赖于位点特异性核酸酶（如CRISPR-Cas9）产生的靶向双链DNA（dsDNA）断裂，然后通过非同源末端连接途径（NHEJ）易错修复断裂。在此过程中，每个单细胞可以获得靶位点中的伪随机突变特征（即插入缺失突变）。一些研究使用这些突变特征作为条形码，在斑马鱼和其他小动物胚胎发育过程中原位追踪细胞谱系。拓展这些分子记录器的编写周期，可以得到进化条形码。这种记忆框架是通过将前间区序列邻近基序（简称PAM）工程插入gRNA编码位点得以创建，从而产生在条形码迭代周期中自我靶向的gRNAs（stgRNAs），stgRNAs位点被重复地多样化。利用该存储器结构可以构建种群级同源记录器和动态条形码哺乳动物细胞系的细胞谱系。

这些储存器结构对dsDNA断裂和NHEJ的依赖限制了它们的书写周期，使它们不适合用于缺乏有效NHEJ途径的生物体，例如大多数原核生物。NHEJ的缺失发生率可导致stgRNA短缺和PAM丢失，从而使记录器随时间推移失去功能。此外，在同一细胞中编码多个stgRNAs可能导致非必要的染色体重排和细胞毒性。为了应用于高分辨率谱系追踪，这种策略还需要效率改进、延长编写周期、降低毒性和增加持久性。替代性方案是利用C或A丰富的stgRNAs与碱基编辑结合，可以提高伪随机储存器的储存容量、精确度和持久的储存状态。

第二类伪随机DNA编写器建立在Cas1和Cas1蛋白上，它们自然地介导了CRISPR细菌免疫系统。在这个系统中，Cas1-Cas2复合体取样细胞内ssDNA池，并将来自池中的短片段（大约20-30碱基对）ssDNA片段整合为预先存在的CRISPR阵列之中，从而实现随时间推移的阵列扩展。新的间隔被添加至领先的-近端位置，因此间隔添加事件的时间顺序在阵列中得以保留。通过将Cas1-Cas2录音带的表达置于信号诱导启动子控制下，并将外源寡核苷酸导入大肠杆菌细胞群，Shipman等人证明可以从阵列的扩展推断信号强度和持续时间，从阵列组成推断添加寡核苷酸池的时间顺序。随后的研究，作者证明，人工数字信息（例如小图片和电影）可被编码到寡合苷酸池中，然后被细胞群体的分散基因组DNA记录。

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精确DNA编辑器的应用包括：分层分子记录、计算和人工学习基因电路。由精确的DNA编辑器产生的突变，因其精确和定义特质，可被分层于更复杂的遗传回路中，其中一种元素的突变结果作为其他元素的输入。多个存储器之间建立明确的关于输入信号的形式记录，这种策略已经被用于记录多种形式的组合、顺序和时序以及其他日益复杂的计算操作。此外，这种遗传程序赋予细胞人工学习能力，例如它们可以逐渐加强（或降低）对特定电路的响应，这与神经元的突触互连增强非常相似。

短暂的细胞事件，例如蛋白质-蛋白质相互作用，可以转化为转录输出被DNA记忆捕捉。例如，一个精确的DNA编写器的N端和C端结构域与条码诱饵和猎物分别融合以记录蛋白质-蛋白质相互作用。在研究相互作用网时，重组一个功能DNA编写器，在诱饵特异性条形码旁边写入一个猎物特异性条形码，然后通过序列检索，以高通量的方式识别库中的交互伙伴关系。类似的策略同样适用RNA活性和蛋白质变异文库高通量功能研究。

伪随机DNA编写器的应用包括：谱系追踪。在发育过程中捕获细胞祖先关系并创建相应谱系图，在大型动物中，细胞发育生物学是一个长期挑战。传统上，静态的遗传和非遗传条形码方法，一旦细胞接收一个条形码，它就会将其无差别地传递给后代，因此造成谱系树分辨率较低。DNA编写器可灵活地创建动态遗传条形码，从而实现高分辨率谱系图。伪随机DNA编写器对谱系追踪问题特别有用，因为它们可以从初始克隆群体出发生成许多不同的突变特征。

现有的DNA编写技术特征和特定应用

1）分子记录。在生物系统中，许多分子事件非常短暂，因此很难在自然环境下检测和研究。DNA编写可以用来创建分子记录仪，捕捉这些瞬态信号，并稳定地将它们编码到单个细胞或细胞群体DNA中。累积下来的突变可通过DNA测序或功能分析加以检索，以推断原始信息。换句话说，就是让活细胞变成记录装置，这些记录装置将自身信号动态历史储存为永久的DNA记录，反过来为研究人员提供它们在自然环境下的生物过程的纵向洞察力，而不仅仅是一些快照。

目前有一些策略，包括条件转录或转录后激活DNA编写器组件，可用于将给定DNA编写器的活性偶联至目标信号。例如，通过信号-响应启动子，诸如是否存在、持续时常、强度、时序和时间相关的生物线索（如代谢物和细胞因子）或者环境线索（如光、污染物、噬菌体或温度变化）等记录信息都可被写入DNA。

自然发生的信号-响应启动子可以与DNA编写器的活性相关联，并用作记录和研究相应信号通路动力学的媒介。如果需要，还可以定向设计或定向进化解偶自然启动子和避免不必要的重叠途径（例如，通过去除相应转录因子的结合位点），或设计响应动力学发生改变的合成启动子。另一种选择是，根据期望的响应信号，在转录后实现DNA编写器的条件激活：例如，通过调节DNA编写器组件之间的构象或相互作用，实现信号依赖性改变。

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原文检索：Emerging applications for DNA writers and molecular recorders

（生物通：伍松）