上海交大2019级博士生Cell Res发现基因编辑新切割方式

　　研究首次证明了Cas9在非互补链PAM位点上游-5，-6的切割活性，并否定了此前认为的不同长度的切割产物是由于Cas9存在外切酶活性所致这一假设。

　　

基因编辑在生物医药和生命信息等领域中一直扮演着重要的角色，传统的基因编辑技术由于构造困难因此在一定程度上阻碍了它的发展，而CRISPR/Cas9技术的问世则很好的克服了这一缺点。CRISPR/Cas9系统是细菌和古生菌的一种天然免疫系统。当外源核酸入侵时，Cas9蛋白就会在RNA的介导下定向切割核酸，发挥免疫功能。经过改造后的第三代基因编辑工具CRISPR/Cas9因其简单，高效，低廉等优点为广大科研工作者所利用。但即便如此，人们对Cas9蛋白的切割机制和切割后的修复机制还知之甚少。

近期，上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学中心吴强课题组在基因编辑领域又取得新进展，国际著名OA学术期刊《细胞发现》发表了题为“Cas9 has no exonuclease activity resulting in staggered cleavage with overhangs and predictable di- and tri-nucleotide CRISPR insertions without template donor”的最新研究成果。该研究发现了SpCas9新的切割方式，并首次提出SpCas9没有外切酶活性。

在以往的研究中，以CRISPR/Cas9领域的权威杜德娜（Doudna）和夏庞蒂埃（Charpentier）为代表的科学家们普遍认为Cas9只能在PAM位点上游3碱基处切割DNA双链产生平末端，并把在体外切割实验中观察到的长短不一的切割产物解释为Cas9的核酸外切酶活性。但近年来随着研究的深入，越来越多的证据表明Cas9蛋白存在切割产生粘性末端的活性。这一颠覆性成果由吴强课题组首先取得，相关文章于2018年8月正式发表在国际权威期刊Molecular Cell《分子细胞》上，该文章第一次明确提出Cas9存在在非互补链PAM位点上游4碱基处切割产生粘性末端的活性，颠覆了传统的认知。

虽然Cas9在PAM位点上游4碱基处切割产生粘性末端的活性已经得到了承认，但对于Cas9是否存在其他的切割活性仍然存在争议。

围绕这一问题，吴强课题组致远荣誉计划2019级博士生石欣和博士后寿佳利用一对sgRNA对DNA片段进行编辑，并对重排接口进行了高通量测序分析。结果表明不仅单碱基的插入存在着规律，两碱基甚至三碱基的插入也同样存在着相似的规律且这种插入可以精准预测：它们由PAM位点上游-4，-5，-6位碱基所决定。这种规律性的两碱基，三碱基的插入暗示SpCas9存在着PAM位点上游-5，-6位切割的活性，这种新的发现作为一种补充，不仅扩大了人们对于SpCas9切割活性的认知，还从另一侧面验证了Cas9的在PAM位点上游4碱基处切割的活性。至此，吴强课题组修改了现有的模型，并提出了新的切割连接模型。

为了进一步直观地验证这种新的切割活性，石欣和寿佳还进行了体外切割实验并对切割产物进行了高通量测序分析，结果表明对于非互补链，Cas9切割后产生了不同长度的突出末端的切割产物，即产生了一个碱基，两个碱基，三个碱基的5’突出末端。而对于互补链，切割产物长度一致。这一体外实验不仅更直观地表明Cas9在非互补链PAM位点上游-4，-5，-6位的切割活性，还对互补链的切割只发生在PAM位点上游3碱基处进行了验证。值得注意的是，该研究第一次在体外切割实验中直观地证实了Cas9的产生粘性末端的切割活性。

总之，该研究首次证明了Cas9在非互补链PAM位点上游-5，-6的切割活性，并否定了此前认为的不同长度的切割产物是由于Cas9存在外切酶活性所致这一假设。不仅如此，该项研究还为精确可控的两碱基、三碱基的基因编辑奠定了基础，并为人类遗传疾病的治疗提供了潜在的方向。在基因编辑如火如荼的今天，使用单个sgRNA切割造成基因失活早就成为常态，但利用一对sgRNA对DNA大片段进行编辑，并将其用于基因组元件及染色质三维结构方面的研究还并未成熟。可以预见，该研究不仅在基础研究领域发挥重大作用，同时还有望推动对精确基因编辑及细胞修复机制的进一步深入理解。

吴强课题组长期致力于基因编辑技术的研究，尤其关注于DNA大片段编辑。在2015年，课题组博士李金环和寿佳就在《分子细胞生物学》杂志发表了关于DNA大片段编辑的一系列系统性的工作。通过一对sgRNA的使用，产生的两组四个断裂末端连接后会产生包括DNA片段删除，反转，重复，易位等重排结果。课题组开发的DNA大片段编辑技术不仅方便了基因组元件功能的研究，还为疾病模型的建立提供便利。同年，吴强课题组利用DNA大片段编辑技术研究了CTCF蛋白的结合位点的方向性与染色体高级结构之间的关系，通过对CTCF结合位点的反转，结合计算生物学揭示了CTCF蛋白结合位点的方向性在染色质高级结构中的重要规律，相关结果发表在国际顶级期刊Cell《细胞》上。不仅如此，课题组还利用DNA大片段编辑技术对原钙粘蛋白脑发育功能进行了研究，相关进展于2018年6月发表在eLife上。

上海交通大学吴强为通讯作者，交大致远荣誉计划2019级博士生石欣和博士后寿佳为共同第一作者，石欣同学今年6月以优异成绩毕业于南开大学，于九月正式到上海交大报到。该研究得到国家自然科学基金委员会和科技部的资助。

原文标题：

Cas9 has no exonuclease activity resulting in staggered cleavage with overhangs and predictable di- and tri-nucleotide CRISPR insertions without template donor

https://www.nature.com/articles/s41421-019-0120-z