创新技术：多色免疫组化的新选择 将核酸标签技术融入免疫检测

　　如何在一张小小的样本切片上同时了解几十种抗原的分布信息？且看精彩创意

　　

深入了解肿瘤微环境的复杂性，对于理解驱动疾病的分子和细胞机制非常重要。浸润的免疫细胞与细胞基质重塑之间的空间关系被普遍认为是定义肿瘤异质性的关键组成部分。如何在一张小小的样本切片上同时了解几十种标志物的分布信息？过去只能想想罢了。直到多色荧光标记的出现。不过，限于可见光谱的范围、避免荧光探针之间发射光谱相互重叠的干扰，多色免疫荧光通常就是使用2-3色荧光，最厉害的是PerkinElmer公司的Opal 7色荧光免疫试剂盒，可以检测同一张切片上多至6种抗原（另外一个颜色留给DAPI）。

科学家的创新能力是永远不可低估的。斯坦福大学Garry Nolan实验室的Julia Kennedy Darling博士后开发了一种技术，可以在一张组织切片上检测多达50种不同抗原！还能很好的克服光谱重叠的问题！这就是CODEX技术。Darling博士还成立了一家名为Akoya Biosciences的公司来实现这一技术的商业化（Akoya珍珠那个Akoya，很日系）。

CODEX能找出那么多种能相互区分的荧光染料？！并没有。它其实每次只用3色荧光——以保证能足够好地相互区分。可是要检测近50种之多的抗体，怎么特异区分每个抗体呀？蛋白又不是核酸、能通过序列匹配来特异识别特定序列。。。嗯？？？

CODEX的巧妙在于，每个检测抗体上标记的不是荧光染料，而是一种寡核苷酸“条码标签”（Barcodes）；各自带有不同条码标签的几十种抗体混合后，可按普通混合一抗操作，与切片共同孵育——此时切片上各种抗原靶标都分别结合了各自对应的抗体，而各抗体上则带有不同的“条码标签”，等待荧光染料识别。这相当于借助抗体免疫识别，给切片上的每种抗原靶标带上了特异的寡核苷酸“条码标签”。后面就可以用类似核酸的方法进行检测了！

CODEX的荧光标记报告子其实就是让荧光染料分子分别偶联上各种能特异识别/结合“条码标签”的一小段寡核苷酸。

荧光成像是分次进行的，每次检测3种靶标：加入3色荧光标记报告子，报告子识别并结合到对应的条码上，使得荧光染料随之附着在相应的抗体和抗原上，被成像记录；然后在温和条件下剥离洗脱荧光标记报告子，再加入识别其他条码的3色荧光标记报告子，显色成像，剥离洗脱，如此重复，直到检测完所有靶标。图像经过叠加处理后，就可以在同一张样本切片上显示出多达50种不同的靶标的空间分布和相互位置关系。是不是有点像“膜芯片的多次重复杂交”？

通过将抗体标记上核酸序列标签，用特异核酸序列匹配来代替傻傻分不清同源一抗的二抗，再利用分次杂交检测，这种方法可以很好的解决多重检测的荧光染料发射光谱重叠的问题，原理简单却非常强大。新产品刚刚推出，按照其资料，已验证该方法适用于人和小鼠样本冰冻切片和石蜡切片。

当然，要完成反复多次的检测，需要一套CODEX系统，能够与多种品牌的实验室自有显微镜适配，且自动完成多次循环操作和记录结果；通常一个组织的数据获取约需时几个小时到半天。

此外，还需要Oligo Barcode标记的抗体：AKOYA既提供常用的CD系列的Oligo标记抗体，完整的试剂解决方案；也提供让客户自行标记自选抗体的CODEX偶联试剂盒，包括其专利的Oligo Barcode和对应检测报告子。

核酸序列识别代替二抗一抗结合，可缺少了信号放大效应，对于表达特别低的抗原靶标怎么办？
用TSA(Tyramide Signal Amplification™，酪胺信号放大技术)呀：简单来说，先完成全部抗体显色成像后，再针对低表达抗原进行信号扩增——用能匹配该抗体信号标签的HRP-Oligo进行多至3轮的催化/沉积TSA荧光染料至抗原所在位置，去除HRP-Oligo后，用标准滤镜（Cy3，Cy5，AF750）成像。值得留意的是TSA介导的染料沉积是不可去除的，所以这一步放最后。

总之，创新的CODEX技术能够以全自动化流程，实现在单一张组织切片上同时对几十种靶标（多达50种）进行单细胞分辨率、包含空间分布信息的全面分析，有望成为新的研究利器。

人类扁桃体组织切片，检测41种不同的生物标志物，可对多种细胞类型及其相互作用进行可视化和深入分析，包括B细胞（CD19、CD20）、T细胞（CD3）、螺旋细胞（CD4）、细胞毒性细胞（CD8）、DendriticCells（CD123）、浆细胞（CD38）、NK-细胞（CD56）、Granulocytes（CD15）等。