单抗类药物研发及相应细胞系开发方法探讨

　　单克隆抗体生物类似药需要企业具有非常强大的创新能力，包括最先进的分析来确定产品的初级和高级结构，选择合适的动物模型，仿真工具和复杂的设备，针对合适的研究终点和通过尽可能少的患者尽快设计适当的临床试验。同时，还需要现代化的生产设备和技术，才能够开发和生产出单克隆抗体生物类似药。

　　

背景介绍

未来几年生物类似药(biosimilars)市场将呈现急剧扩容之势。这种增长在很大程度上基于这样的事实：随着多只“重磅炸弹”级单克隆抗体(mAb)生物制品专利到期，单克隆抗体生物类似药有望在未来几年内获得批准上市。

单克隆抗体生物类似药需要企业具有非常强大的创新能力，包括最先进的分析来确定产品的初级和高级结构，选择合适的动物模型，仿真工具和复杂的设备，针对合适的研究终点和通过尽可能少的患者尽快设计适当的临床试验。同时，还需要现代化的生产设备和技术，才能够开发和生产出单克隆抗体生物类似药。整个流程中抗体制备技术及细胞株筛选方法选择至关重要。

抗体制备技术

目前单克隆抗体制备技术主要有：杂交瘤技术、EBV 转化B 淋巴细胞技术、噬菌体展示技术、转基因小鼠技术以及单个B 细胞抗体制备技术。

▪ 传统的鼠杂交瘤单克隆抗体技术得到的鼠源抗体免疫原性高、半衰期短，往往临床疗效不显著，需要人源化改造或者使用人骨髓瘤细胞系来改进杂交瘤技术。
▪ 研究者利用EB 病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在体外能感染正常静止的B 细胞，使它们变成永生化的淋巴细胞系这一特性，制备分泌人单抗的杂交瘤细胞，即EBV 转化B 细胞技术。然而，EBV 转化B 细胞株不是恶性肿瘤细胞，较难克隆且抗体产量低，因而仍然没有得到广泛应用。
▪ 噬菌体展示技术是目前广泛应用的体外筛选人源抗原特异性抗体可变区基因的一种方法，噬菌体展示是将抗体DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使抗体随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
▪ 除此之外，转基因鼠抗体制备技术在破坏鼠内源抗体基因后导入人抗体基因，进而用目标抗原免疫转基因鼠并在其体内表达人源抗体，这种方法得到的抗体产量和亲和力较高。
▪ 单个B 细胞抗体制备技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B 细胞抗体基因技术，这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全人源、需要的细胞量少等优势。

单个B 细胞分离手段

B细胞分离常用的方法主要有3种：微阵列芯片系统、流式荧光分选仪、高通量纳米孔板筛选平台（HT-NIC）。他们的一些区别对比如下：

单个B 细胞抗体制备技术相对比较先进和可靠，在国外逐渐成为主流的方法，国内暂时还无法大规模应用。但随着大批高水平技术专家海外归来创业，这个应用领域正在蓬勃发展中。

细胞株筛选

单抗药物最常用的表达系统为CHO哺乳动物细胞，筛选稳定的CHO细胞株常用的方法主要有4种: 传统有限稀释法、细胞铺板设备+图像验证法、半固体培养基筛选法、高通量纳米孔板筛选法（HT-NIC）。

▪ 传统有限稀释法是早期最广的单克隆细胞株筛选法，理论上可以得到非常均一的单克隆，同时可以筛选悬浮细胞稳定株。其缺点是起码需要一次以上的亚克隆，而且细胞生长效率较低，技术人员的工作量非常大。重要的是由于整个过程中人为因素过多，往往会被FDA的评审专家要求提供更多更详细的图像补充资料，影响审评效率。
▪ 细胞铺板设备+图像验证法是在传统有限稀释法的基础上利用自动化的设备来把单个细胞铺到96孔板里面，然后使用细胞成像仪来验证其单克隆性。其核心原理是96孔板的有限稀释法，效率有了很大提升，筛选周期可以减少到一轮。但也无法避免细胞生长效率低、铺板过多等固有缺点。
▪ 半固体培养基筛选法是以前一段时间内工业上较为流行的筛选法。但随着转染效率的改善，筛选通量需求大幅降低；加上该方法的单克隆效率低、荧光染料问题、后期驯化及需要多次亚克隆等数个缺点，导致越来越多企业优选其他方案。
▪ 高通量纳米孔板筛选法（HT-NIC）是最近兴起的一种先进技术。该技术优化了接种密度和培养效率，同时保留了充分的图像证据链。HT-NIC只需要一轮的筛选，具有高单克隆率、高通量、节省时间和空间等多个优点。

HT-NIC平台，全称High-Throughput Nanowell-based Image-verified single cell Cloning（基于图像验证的高通量细胞筛选法）。HT-NIC有机地将ALS公司的高精度单细胞挑捕获系统CellCelector和Nanowell纳米孔板结合起来。把CHO细胞铺于Nanowell板后，HT-NIC平台可连续检测细胞的生长状态，1周内我们就可以实现单克隆源性的确认及单克隆影像学拍照，较大提高稳定高产CHO细胞株筛选效率。HT-NIC提供完整的可溯源的图像验证，单克隆性证据满足FDA认证的需求。

CHO细胞株筛选常见问题：

1、单克隆生长效率：经常做有限稀释筛细胞株的朋友会发现，很难达到一块96孔板长10个单克隆（0.1 Cell/well 细胞密度铺板），原因很多也比较复杂。如果单克隆孔数量不够，就需要增加铺板的数量，所以现实情况往往需要40-90块板，工作量变得也非常的大。使用半固体培养基，细胞生长效率提高，但是后期验证时需要重新驯化。而HT-NIC使用的是纳米孔，每个Nanowell的体积只有4nl，在“共培养”效应下，细胞生长效率大大提高，更好的加快细胞的生长。

2、筛选周期：国内外对于细胞的单克隆源性要求越来越高，以前两轮有限稀释或者两轮半固体培养基即可，根据目前要求肯定不行。FDA已经明确规定，至少要做泊松分布来提供单克隆概率。根据最新消息，很多企业的申报代理机构已明确要求额外提供单克隆证据材料。所以细胞铺板设备+图像验证法和高通量纳米板筛选法（HT-NIC）都只需要一轮，逐渐成为主流的选择。

3、耗材和空间：由于成本的原因，现在的企业大多采用有限稀释法或者是有限稀释+成像仪来确定单克隆性，在技术过程中，需要多次对项目所有细胞板进行扫描拍摄，那么如何降低铺板数量，成为很多企业比较头疼的问题。在这个方面，半固体培养基筛选法和HT-NIC都是表现不错，大量减少耗材和空间，成为真正高通量的选择方案。

高通量纳米孔板筛选法（HT-NIC）具有高通量、筛选周期短和减少耗材空间等多种优点，成为目前筛选稳转细胞株的最优秀方案。目前中国抗体药物产业正进入关键的发展时期，高通量的HT-NIC平台既可以实现单抗药物前期开发的B细胞筛选，又可加快CHO高产细胞株的筛选, 提供完整的可溯源的数据验证，快速推进FDA申报审批。

深入了解单克隆抗体制备技术及细胞株筛选方法

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