中国科学家6月参与发表多篇Nature及其子刊文章

【字体: 时间:2019年06月28日 来源:生物通

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生物通报道:6月中国学者参与的多项研究在Nature杂志及其重要子刊上发表,其中包括证实了DNA碱基编辑器会造成数以万计个非靶向RNA单核苷酸变异,NLRP3炎症小体激活新机制,以及利用CRISPR找到一种自闭症的灵长类动物模型。

DNA碱基编辑能够在不产生任何双链断裂(DSBs)的情况下对基因组DNA进行直接点突变校正,但潜在的脱靶效应限制了它的应用。腺相关病毒(AAV)是最常见的DNA编辑基因治疗呈递系统。由于这些病毒能够长期维持体内基因表达,因此DNA碱基编辑诱导的潜在RNA靶外效应对其临床应用具有重要意义。

之前的几项研究已经评估过DNA碱基编辑的基因组DNA非靶向突变。同时,研究表明与常用DNA碱基编辑器整合的脱氨酶经常表现出RNA结合活性。例如,在胞嘧啶碱基编辑(CBEs)中使用的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1被发现可以打靶DNA和RNA,在腺嘌呤碱基编辑(ABEs)中使用的腺嘌呤脱氨酶TadA被发现会诱导RNA上位点特异性肌苷形成。然而,任何由DNA碱基编辑器引起的潜在RNA突变都没有被很好地评估。

为了在RNA水平上评价DNA碱基编辑的脱靶效应,中国科学院神经科学研究所杨辉课题组与中国科学院计算生物学研究所和四川大学的研究人员计算了CBE或ABE处理细胞中每一个被复制的靶外RNA SNVs,并探讨了通过DNA碱基编辑的工程脱氨酶消除靶外RNA SNVs的可能性。

他们将一种类型的CBEs,BE3(APOBEC1 -nCas9-UGI),或一种类型的ABEs,ABE7.10(TadA -TadA*-nCas9),连同GFP和/或无向导RNA(sgRNA)一起转染到HEK293T培养细胞中。在这些HEK293T细胞中,通过BE3和ABE7.10验证了DNA编辑的高靶向效率后,他们对这些样品进行了平均深度为125X的RNA测序,并定量评估了每个复制中的RNA SNVs。

CBE或ABE处理细胞的每次复制都进行靶向编辑效率评估以确保有效编辑,然后将CBE和ABE处理组的非靶向RNA SNVs数量与GFP对照组进行比较。结果发现在DNA碱基编辑处理的细胞中,RNA SNVs的数量显著增加。

此外,研究人员发现,BE3或ABE7.10处理细胞的突变偏向分别与APOBEC1或TadA的相同,表明靶外效应是由DNA碱基编辑的过度表达引起的。他们还鉴定了这些非靶向RNA SNVs的CBE和ABE特异性基序和遗传区域。

北京大学物理学院、人工微结构介观物理重点实验室、定量生物学中心毛有东课题组与哈佛医学院吴皓课题组通过冷冻电子显微镜方法解析了人源NLRP3-NEK7的复合物3.8埃分辨率的结构,并通过NLRP3或NEK7突变体的体外和细胞功能研究,系统揭示了NEK7与NLRP3亚基的多界面相互作用,以及其介导NLRP3炎症小体激活的分子机制。

研究人员通过重组表达,在昆虫细胞中表达量人源N端PYD截短、融合MBP标签的NLRP3,通过大肠杆菌表达了全长的人源NEK7。但是天然复合物的冷冻电镜图片对比度很差(分子量185KD)。于是作者通过人工干预,基于二聚体蛋白激酶R,设计了人工的NEK7使其二聚化,改善了复合物的电镜数据质量。最终,课题组获取了高分辨的复合物冷冻电镜图片,通过整合倾斜样品和非倾斜样品的数据,以及基于机器学习的数据聚类,对结构精化做了一系列优化,解析了其三维结构,分辨率达到3.8 Å。

对NLRP3的结构和功能的研究证明NLRP3-NEK7相互作用决定了NEK7许可对NLRP3炎症小体激活的必要性,为进一步研究NLRP3炎症小体激活的分子机制提供了重要基础,为相关疾病的分子医学研究提供了必备的分子依据和药物治疗靶点。

此外,还有由中国科学院深圳先进技术研究院,美国麻省理工,中山大学和华南农业大学多处科学家组成的研究团队公布了一项重要的研究新成果:利用基因组编辑系统CRISPR,研究人员设计了与自闭症和人类其他神经发育障碍相关的基因突变的猕猴模型。这些猴子表现出一些行为特征和大脑连接模式,类似于相同情况的人类。

我们都知道,自闭症具有强大的遗传基础。目前科学家已经确定了数百种与ASD相关的遗传变异,但其中许多变异相关性不高。在这项研究中,研究人员聚焦于一个具有强烈关联的基因:Shank3。

除了与自闭症有关外,Shank3的突变或缺失还可引起相关的罕见病,比如Phelan-McDermid综合征,其最常见的病征包括智力残疾,言语和睡眠受损以及重复行为。这些人中的大多数也被诊断患有自闭症,因为它们的许多症状重叠。

Shank3编码的蛋白质存在于突触中,这是大脑细胞之间的连接点,允许它们相互通信。Shank3在纹状体中特别活跃,这一大脑区域涉及运动计划,动机和习惯行为。张锋和他的同事之前曾研究过Shank3突变的小鼠,发现它们显示出一些与自闭症有关的特征,包括避免社交互动和强迫性重复行为。

尽管小鼠研究可以提供有关疾病分子基础的大量信息,但使用它们来研究神经发育障碍也存在缺陷。特别是,小鼠缺乏高度发达的前额叶皮层,这是许多灵长类动物的独特特征,例如做出决定,保持集中注意力。

CRISPR基因组编辑技术的发展为设计编辑基因突变,送入猕猴中提供了新的方法,这在以前很难做到。因此研究人员将CRISPR成分注入到猕猴受精卵中,产生带有Shank3突变的胚胎。

结果发现具有Shank3突变的猕猴表现出与具有突变基因的人类相似的行为模式。它们往往在夜间醒来,表现出重复的行为。与其他猕猴相比,它们的社交互动也更少。磁共振成像(MRI)扫描也揭示了与自闭症相似的人类模式。
(生物通)



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