CRISPR敲除技术揭示豆血红蛋白协同调控豆科植物根瘤高效固氮的分子机制

　　这项研究系统的解析了百脉根豆血红蛋白（LjLb1/2/3）协同调控根瘤高效固氮的分子机制，揭示了Lb参与维持ROS稳态的新生物学功能，并初步阐明质体中血红素小分子合成在转录后水平的系统调控途径

　　

华中农业大学生命科学技术学院在New Phytologist在线发表了题为“CRISPR/Cas9 knockout of leghemoglobin genes inLotus japonicusuncovers their synergistic roles in symbiotic nitrogen fixation”的研究论文。我校博士研究生王龙龙为该论文的第一作者，生命科学技术学院端木德强教授为通讯作者。

豆科植物-根瘤菌共生固氮被认为是目前最为高效的一种生物固氮体系。豆血红蛋白(Leghemoglobin, Lb)是根瘤中最丰富的一类蛋白，约占成熟根瘤总蛋白含量的5%以上。学术界很早就提出了关于Lb功能的假说：根瘤细胞内高浓度的Lb创造了一个相对低氧的环境，对固氮酶起到保护作用，同时，Lb又能够传递低浓度、高通量的氧气到线粒体及类菌体，以维持活跃的细胞呼吸。但该假设大多基于Lb和固氮酶的体外生化等研究结果，缺乏体内研究结果的支持。

研究以豆科植物百脉根（Lotus japonicus）为模式植物，利用CRISPR/Cas9系统成功的创建了豆血红蛋白（LjLb1/2/3）单基因、双基因和三基因突变体（单突，双突和三突）。三突呈现明显的缺氮表型,双突、单突缺氮表型依次递减。结合互补实验，单个Lb均可部分互补三突表型，非共生相关的植物血红蛋白不能互补三突表型，而非豆科来源的共生血红蛋白则可以部分互补三突表型。

研究证实了Lb是维持根瘤高效固氮不可或缺的重要组分，突变体共生表型分析及功能互补实验首次揭示了Lb家族基因间的功能协同性、共生与非共生血红蛋白的功能分化以及豆科与非豆科共生血红蛋白间的趋同进化关系。

为了进一步挖掘Lb在维持根瘤固氮过程中的重要生物学功能，对Lb三基因突变体展开系统性研究：显微观察揭示了三突根瘤提前衰老表型及线粒体形态异常；RNA-seq分析发现，差异表达基因中除了包括碳代谢、氮代谢途径相关基因外，还包括一系列转录因子、蛋白酶及血红素合成代谢相关基因等，为深入研究Lb功能和根瘤衰老/早衰奠定了基础。

更有趣的是，Lb的缺失导致根瘤细胞内出现严重ROS积累，说明Lb除了结合和传递氧气之外，还可能参与了维持根瘤内部ROS的动态平衡。

由此，这项研究系统的解析了百脉根豆血红蛋白（LjLb1/2/3）协同调控根瘤高效固氮的分子机制，揭示了Lb参与维持ROS稳态的新生物学功能，并初步阐明质体中血红素小分子合成在转录后水平的系统调控途径，这些结果为研究成熟及衰老根瘤中的代谢调控、氧化还原平衡及信号转导通路等奠定了很好的材料与理论基础。

原文标题：

CRISPR/Cas9 knockout of leghemoglobin genes inLotus japonicusuncovers their synergistic roles in symbiotic nitrogen fixation

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.16077