Nature Methods：全新CRISPR蛋白优化平台，提升基因编辑酶的准确性和效率

　　全新技术能够大量组装及有系统地引入多点修改到蛋白质变体中，并以条形码编码同时分析各个组合在筛选过程的频率变化，在众多组合中寻找出最合适的组合修改。

　　

蛋白质优化工程能够改良抗体、生物酶及其他蛋白质如基因编辑酶等，赋予新的特性或提升现有功能，实现临床和研究应用的需要。修改氨基酸序列是蛋白质优化工程中的核心技术之一。近年，CRISPR-Cas基因编辑酶已成为医学研究的重要工具。全球科学家正努力改良CRISPR-Cas酶，借修改其氨基酸序列，在多点位置换入其它氨基酸，以提高基因编辑的准确性和效率，以及提升修改致病基因治疗的安全性和有效性。

香港大学李嘉诚医学院（港大医学院）生物医学院的研究团队成功开发一套全新技术，能够大量组装及有系统地引入多点修改到蛋白质变体中，并以条形码编码同时分析各个组合在筛选过程的频率变化，在众多组合中寻找出最合适的组合修改。

这种新方法被称为：CombiSEAL，相关研究成果公布在Nature Methods杂志上，由黄兆麟博士领导完成，目前已提交专利申请。

目前改良CRISPR-Cas酶以及其他蛋白质的挑战，在于从众多氨基酸序列组合变化中，筛选出最合适的氨基酸替代组合。过多或过少的修改，可能对提高基因编辑酶的准确性和效率有负面影响。然而多个氨基酸变化的组合效应难以预测，并且随著每个额外氨基酸的修改，蛋白质突变组合数量也大量增加。传统定点诱变技术可逐一产生蛋白质变体，但不能建立具有多个变化的大型氨基酸变体文库，进行大量的同时平行分析（massively-parallel analysis）。发展新的技术平台，以大幅提高组装和分析蛋白质变体的能力，有助于加速开发新一代高效基因组编辑酶。

在这篇文章中，研究人员开发了一种新技术能够大量组装，有系统地引入多点修改，这方法比传统的逐一建构及检测个别定点突变的变体，更为省时，且成本可大幅降低，而且更可以直接在人类细胞表达基因编辑酶及其他治疗性蛋白质的活性。

研究团队将其命名为“CombiSEAL”，利用这一技术，他们成功筛选出拥有更高基因编辑准确性的新Cas9基因编辑酶变体。新变体在不损失活性及靶点选择范围的同时，降低基因编辑错误的可能性。CombiSEAL技术平台易于使用，可以用作高通量筛选并改良更多临床应用的蛋白质，提升治疗效果。

SpCas9 是CRISPR-Cas系统中最被广泛应用的基因编辑酶。研究团队利用CombiSEAL技术，快速建造了948个SpCas9变体，这大型的蛋白质文库中，每个变体包含1至8个氨基酸的替代修改。团队将这文库递送到人类细胞中进行测试，有系统地量化每一个变体的基因编辑效率和准确性。

在这项研究中，SpCas9蛋白变体的数量大大超过所有迄今已被报导的研究的变体总和。团队成功筛选出可降低基因编辑错误的两个新变体：Opti-SpCas9 和OptiHF-SpCas9，其中Opti-SpCas9拥有较高的基因编辑活性。

CombiSEAL的简单一锅式反应技术可制造大型变体文库，并以短读测序（short-read sequencing）带有序列条码的蛋白变体，分析每个组合的频率变化，大幅提高筛选的通量。研究团队未来可进一步扩大测试的规模，从而挑选出更优秀的变体。

这项研究的重要性包括：
（1）港大医学院团队开发的CombiSEAL平台，突破传统技术，首次引入序列条码标籤蛋白基因的变体，成功以高通量测序方法，快速分析多点氨基酸的变化组合，以瞭解变体组合与蛋白酶活性的关係。新的技术平台可以广泛应用于不同领域的实验室，例如生物医学、应用医学，新药及抗体开发和生物科技等，实现高通量表徵及筛选蛋白质变体。

黄兆麟博士表示：“这是一个大规模的构建与测试平台，用于寻找最佳变体组合以优化蛋白质。一锅式组装技术和引入序列条码，大大减少了建构变体库及其功能表徵的时间和成本。”

(2）团队筛选出新改良的基因组编辑酶变体Opti-SpCas9。黄兆麟博士指出：“Opti-SpCas9的准确性较高，对改善基因编辑术在临床应用的安全性很有帮助，它同时拥有高编辑效率和保持了广泛靶点范围。”Opti-SpCas9与其他新改良的SpCas9变体不同，它是唯一可用于U6启动子下，可转录含有额外5'guanine的gRNAs，而不影响其效率的改良版 ；而这个特质有一个很重要的应用，因为要进行成千上万sgRNA的大型基因组扫描（CRISPR-based genetic screen），必须要使用效率良好的U6启动子，而Opti-SpCas9正具备进行大型扫描所需要条件，因此它将可以广泛地被应用于高通量基因组筛选研究。

黄兆麟博士致力开发各种基于组合遗传学的高通量筛选技术，用以剖析包括癌症在内等疾病的致病机理，从而制定新的治疗策略。早前的研究工作开发了用于分析基因相互作用的CombiGEM技术。研究成果已于2015年在Nature Methods和2016年在PNAS期刊上发表。此外，该团队于2016年在国际期刊《遗传学年度回顾》中发表了一篇评论文章，阐释CombiGEM技术解决生物医学研究的潜力和挑战。而这项研究中开发了新的组合遗传学技术CombiSEAL，更开拓了组合遗传学于蛋白质优化工程的全新应用。

原文标题：

Combinatorial mutagenesis en masse optimizes the genome editing activities of SpCas9