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新技术CRaft-ID:CRISPR筛选+高内涵成像
【字体: 大 中 小 】 时间:2020年10月20日 来源:生物通
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基因敲除是鉴定与表型相关基因的有效方法。CRISPR敲除文库筛选可实现批量敲除而提高了筛选通量,但却不适用于需要成像的筛选,新技术CRaft-ID巧妙地将高内涵成像与CRISPR筛选结合起来,实现基于表型成像的CRISPR筛选,很值得了解一下
研究背景:应激颗粒
应激颗粒是细胞受扰动(如氧化应激,热休克,免疫激活等)期间在细胞质中短暂形成的蛋白质-RNA聚集体。异常的应激颗粒动力学与人类疾病的病理生物学有关——例如癌症和神经退行性疾病等。肌萎缩性侧索硬化症(一种神经退行性疾病,就是大名鼎鼎的霍金所患疾病,也是冰桶挑战所支持的研究对象)就显示出异常改变的应激颗粒的动力学和组成。蛋白质组学方法已经鉴定出定位于应激颗粒的蛋白质;然而,影响应激颗粒丰度的许多基因仍未确定。因此,鉴定调节应激颗粒生物学的遗传调节因子可能将有助于与疾病相关的新疗法。
方法背景
基因敲除,是鉴定与特定细胞表型相关的基因的有效方法。基于CRISPR的汇集文库遗传敲除筛选(Pooled genetic knockout screen)相比传统遗传敲除方法具有可扩展性和性价比的优势,得到了广泛关注。如果再结合单细胞测序的应用,可以对扰动后的整个转录组进行定量分析,从而实现多维分析与遗传改变相关的分子途径。尽管这类方法显著提高了基因敲除研究的运行通量,但高通量筛选通常受限于要使用易于批量筛选的检测方法——比如生长速率,合成杀伤力,或者基于报告分子的荧光分选,而无法通过成像检测以时空分辨率来分析亚细胞表型。
在细胞身份识别和功能分析中,亚细胞表型通常与生理及病理变化密切相关。高通量成像可以无偏倚地捕获细胞响应各种刺激而表现出功能性的和形态学上的细胞状态变化。想要筛选导致这些表型变化的调节因子需要借助阵列方法。将汇集文库筛选与细胞/亚细胞成像读数整合在一起,对于提高基于图像的基因敲除研究的运行通量至关重要。
目前已有研究采用荧光标记核苷酸原位测序技术与汇集CRISPR文库(pooled CRISPR libraries)、基于图像的表型分析技术结合,鉴别出大肠杆菌中与转录因子定位、细胞周期控制和长非编码RNA定位相关的遗传调控因子。
本文这项研究中,研究人员开发了一种新的研究方法——在微筏阵列上进行汇集CRISPR文库筛选(包含>12,000个单向导RNA(sgRNA)),然后通过自动高分辨率共聚焦成像鉴别与应激颗粒相关的调节因子。
微筏阵列(Microraft array)是筛选批量“感染”细胞的一种平台,这篇文章中使用的每个微筏阵列中包含4万个可单独分离的100μm磁性聚苯乙烯“小方块”作为单细胞克隆生长表面(即“微筏”),阵列形式嵌植于聚二甲基硅氧烷(PDSM)”微孔阵列基板,可共享培养基。相邻小方块之间的间隔PDSM可作为单细胞克隆的物理隔离屏障。通过极限稀释铺板,单细胞附着在小方块上,相互物理分离,然而又在共用的培养基中生长,培养得到成千上万的单细胞克隆(每个细胞克隆约5-20个细胞),避免了因为单独处理成千上万细胞培养孔而可能造成的假象。这些支持单细胞克隆生长的微筏彼此物理分离,也能够从阵列种单独取出从而对其上的细胞克隆进行扩展培养和后继分析。
研究内容
为了筛选出能调节应激颗粒丰度的RBP,研究人员开发了针对1,078个RBPs的CRISPR–Cas9 gRNA文库,每个基因10个sgRNA,加上628个靶向必需基因的对照sgRNA和1,070个非靶向性对照sgRNA(包括12个靶向荧光蛋白的sgRNA),合计>12,000 sgRNA。在靶向RBP的sgRNA中,有2,210个被注释为对HEK293T细胞存活至关重要。gRNA文库与用于CRISPR筛选的文库设计相同。
用RBP文库以低感染复数(MOI)(每细胞0.15个病毒颗粒)批量转导HEK293T细胞,并培养7天,以使靶向致死基因的sgRNA从库中耗尽。第7天,将细胞铺板在微筏阵列上并培养3天,以形成小菌落(每个菌落约5-20个细胞)。
由于准备实验时通过细胞核染色定量细胞丰度并确认每个阵列上可形成约6,000个菌落(阵列上15%的孔),为了获得每个sgRNA大约十倍的表达,研究人员共铺板了20个微筏阵列,获得119,050个与应激颗粒丰度潜在相关的基因敲除细胞克隆,再加上一个用作阴性(无胁迫)对照,共接种了124,312个细胞克隆。由于文库中每个RBP都有十个独特的sgRNA,因此在此实验中,每个RBP的覆盖率约为100倍。
应激颗粒的定量需要高分辨率自动共聚焦成像,而这在微筏阵列上是不可行的,于是研究人员使用水溶性粘合剂将一个1毫米厚的载玻片固定在微筏阵列的底部,从而消除了由PDMS材料引起的焦深变化,并可以在整个阵列上进行自动成像。
研究人员使用高内涵共聚焦显微镜对获得的细胞克隆进行成像,并开发了机器学习工具,用于识别CRISPR敲除后具有降低的应激颗粒丰度的细胞克隆。用这个方法鉴定并验证了六种先前已知的应激颗粒调节因子,以及17种RBP,这些RBP耗尽后会减少由亚砷酸钠诱导的人体细胞应激颗粒。
讨论
这项工作说明了CRaft-ID筛选平台将广泛适用的CRISPR汇集文库方法与支持微筏的高内涵成像分析相结合,具有鉴定影响亚细胞表型的遗传因素的能力,是CRISPR筛选在细胞/亚细胞表型读取领域应用的进步和扩展。
该方法采用标准的细胞培养方法,CRISPR文库,现成的共聚焦成像技术和基于PCR的DNA测序,并且无需进行CRISPR库修改,现有CRISPR gRNA库均适合使用,因此可广泛使用。
微筏阵列的操作类似于标准细胞培养皿,因此可以容纳多种细胞类型,包括干细胞和分化细胞。然而,这种方法可能不适用于不能粘附在阵列培养表面的细胞。
CRaft-ID最适合用于筛选基因敲除人群中稀有表型的调节因子,因为必须分离单个微筏并进行PCR扩增以确定感染的sgRNA。手动分离单个目标微筏大约需要2分钟。
CRaft-ID使用传统的基于PCR的测序来鉴定感染的sgRNA。尽管基于图像的测序方法具有识别所有被筛选细胞中存在的sgRNA条形码的优势,但它们需要定制的显微镜设置和数据分析引擎。
此外,CRaft-ID兼容活细胞筛选。虽然在这项工作中,亚砷酸钠处理对冲洗后的细胞具有致死性,应激颗粒的形成是短暂的。因此,在成像前要固定细胞克隆以保留其形态。但是,如果扰动对细胞无致命影响,可以在活克隆上进行成像以捕获内源标记蛋白和细胞形态的动态定位模式,然后从阵列中分离活细胞克隆以进行进一步的基于细胞的研究。
总之,CRaft-ID将CRISPR筛选的应用范围扩展到了高内涵成像,从而可以探询亚细胞和细胞形态表型的遗传调节因子,而这些基因调节因子以前是无法用批量感染的方法进行的。这项研究表明,CRaft-ID能够可靠地识别已知和未知的应激颗粒丰度调节因子,从而提供对应激颗粒生物学的深入了解。该平台可灵活地适用于众多基于成像的表型,在功能基因组学筛选领域将提供新的助力。