在单细胞水平上检测拷贝数变异的新工具

　　研究人员发现某些基因的拷贝数异常与癌症及其他复杂疾病有关。好在，如今的测序技术能够测定细胞样本甚至是单个细胞的CNV。下面我们就来看看一些最新的单细胞CNV检测工具。

　　

拷贝数变异（CNV）是指长度为1 kb以上的基因组片段的拷贝数增加或者减少。有时，这些拷贝数变异中包含基因，那也就意味着这个人的基因拷贝数不是通常的两个，而可能是三个或者四个。

CNV位点的突变率远高于SNP，是人类疾病的重要致病因素之一。研究人员发现某些基因的拷贝数异常与癌症及其他复杂疾病有关。好在，如今的测序技术能够测定细胞样本甚至是单个细胞的CNV。下面我们就来看看一些最新的单细胞CNV检测工具。

DNA扩增工具

在检测和测定基因的拷贝数之前，需要对单细胞中的DNA进行扩增。Takara Bio公司的PicoPLEX WGA系列产品就实现了全基因组扩增（WGA），适用于单细胞CNV检测。Takara Bio生殖健康战略部门的高级经理Kajal Choudhary表示：“它经过优化，能够从低起始量样本（比如单细胞）中无偏扩增基因组DNA。测定少量样本中的全部DNA信息相当困难，因此全基因组扩增技术是测序文库制备中的关键步骤。”

越来越多的研究人员正在测定拷贝数变异和基因表达。“癌症与拷贝数变异之间存在明显的关联，”Takara Bio的NGS产品营销副总监Suvarna Gandlur说。PicoPlex WGA技术可用来测定肿瘤和癌细胞中的拷贝数变异，以了解疾病进展或状态，并将其与基因表达联系起来。

Takara Bio这些PicoPlex WGA单细胞产品的另一个应用是胚胎植入前遗传学检测（PGT）。“利用PGT，单细胞分析可以提供有关非整倍体或遗传异常的更多信息，”Choudhary说。展望未来，他表示可利用全基因组扩增技术来扩增游离DNA，以实现无创的产前检测。“我们对此进行了投资并优化了工作流程，但在广泛采用之前，还需要进行大量的临床验证和测试。”

若想在CNV检测中获得高质量的结果，可靠的样本制备必不可少。QIAGEN全球NGS产品管理副总监Samuel Rulli指出，单细胞测序结果的变化可能源于早期的处理步骤。“结果的变化可追溯到细胞如何分离，如何存储，甚至如何从采集点运送到检测地，”他说。“Repli-g Advanced DNA Single Cell Kit实现了高度均一的DNA扩增，因为它含有一种冷冻保护剂，可最大程度减少单细胞捕获、存储或运输过程中的DNA损伤。”

QIAGEN的Repli-g Advanced DNA Single Cell Kit通过多重置换扩增技术实现了DNA的扩增，且流程简单，只需要2小时20分钟。QIAseq FX Single Cell DNA library kit以“无序列偏好性”的酶切打断方式将DNA进行随机片段化，继而构建文库。“整个流程包括单细胞捕获、细胞稳定（如果要在晚些时候分析）、细胞裂解、DNA扩增，然后通过数字PCR或新一代测序进行分析，”Rulli谈道。

全面的CNV检测平台

单细胞DNA测序可揭示那些在研究大量细胞时可能遗漏的基因组异质性。癌症及其他疾病也往往与细胞亚群或克隆中的基因组异质性有关。10x Genomics的Chromium单细胞CNV解决方案可帮助研究人员鉴定基因组异质性并绘制克隆演变。

基于Next GEM技术的Chromium平台实现了大规模的单细胞集成分析。这项技术的核心之处在于能够产生成千上万个微滴，每个微滴都含有一个可识别的条形码，便于下游分析。Chromium Controller系统采用先进的微流体技术，可以在几分钟之内完成单细胞微滴生成和条形码标记。

10x Genomics的流程从单细胞悬液开始，最终制备出与短读长测序仪兼容的文库。该平台的应用包括评估肿瘤异质性、克隆演变、神经元镶嵌，以及遗传和代谢疾病。据10x Genomics的研发高级副总裁Michael Schnall-Levin介绍，他们的客户已在肿瘤学、神经科学、人类遗传学和干细胞研究等多个领域使用CNV分析。

靶向的CNV检测平台

与全基因组方法相反，Mission Bio的Tapestri平台则采用靶向方法来检测单个细胞中的点突变和拷贝数变异。Mission Bio也是基于微流体液滴技术，每次可分析10,000个细胞。每个液滴包裹单个细胞，作为化学反应的发生场所。不过它的独特之处在于将细胞裂解反应与DNA扩增反应分割开来，这样能够准确重复地测定DNA。

Tapestri平台采用靶向基因组合（targeted panel）来分析多个基因组区域，从而确定正常细胞的扩增基线水平。通过与基线水平的比较，这项技术可以确定拷贝数的变化。“我们可针对整条染色体来设计基因组合，以查看非整倍体，也可以针对单个基因来设计，以了解拷贝数的增减，并鉴定点突变，”Mission Bio的软件和信息学副总裁Anup Parikh谈道。

研究人员可利用Tapestri平台来研究不同类型癌症的进化，它们是由拷贝数变化和/或点突变驱动的。“有时，点突变、杂合性丢失以及拷贝数增加共同驱动了癌症的侵袭性或耐药性，”Parikh说。“这个克隆可能由突变和拷贝数变异驱动，而那个克隆则由三个同时发生的突变驱动。确定每个克隆的驱动因素有助于定制适当的组合疗法。”

如今，MD安德森癌症中心、纪念斯隆凯特琳癌症中心以及加州大学旧金山分校的研究人员正在使用Mission Bio的技术来研究癌症的异质性。“CNV通常是癌症发展的早期驱动力，并指示癌症的严重程度，”Parikh说。“我们将单细胞分辨率的突变和CNV检测视为基本工具，能够更好地了解癌症复杂性，以便人们更快开发出更好的疗法。”

（作者：Caitlin Smith / 生物通编译）