Science重磅：张锋开拓新型检测方法！2小时内现场判断病毒种类，有望用于2019-nCoV的检测

　　研究引入了一种新的样品处理方法，告别了实验室内繁复的核酸提取工作，使得新技术能够直接在患者唾液和血清样本中检测到病毒，同时依旧保持着1个拷贝/微升的灵敏度。该技术也能够更容易、快速地区分几种相关的类似病毒（如寨卡、登革热、黄热病毒和西尼罗河病毒），这些病毒引起的症状相似，对辨明疫情特别有用！

　　

基于核酸的检测方法，确实具有足够的敏感性，检测速度也够快，但往往需要大量的样本和昂贵的设备；抗原检测倒是对设备要求不高，但是特异性差了些，过程更是漫长。

无论是不是这些传播极快、疫情严重的疾病，理想的检测方法都应该兼顾敏感性和特异性，速度要快，费用要低，最好能够同时比对多个对象，同时对设备、技术、资源的要求也要尽可能低。

2019年12月，中国湖北省武汉市发生了一系列急性呼吸道疾病，现在称为新型冠状病毒感染的肺炎。该疾病已从武汉迅速传播到其他地区。截至2020年1月31日，中国共确诊9692例NCP【新型冠状病毒感染的肺炎】病例。国际上已在24个国家和5大洲报告了病例。2020年1月3日，在武汉市一名患者的支气管肺泡灌洗液样本中发现了2019年新型冠状病毒（2019-nCoV），并被确认为造成这种疾病的原因。NCP全基因组测序和系统发育分析表明，2019-nCoV与与人类严重急性呼吸综合征（SARS）和中东呼吸综合征（MERS）相关的β冠状病毒截然不同。

2019-nCoV具有以下特征：冠状病毒家族，并被归类于beta冠状病毒2b谱系。2019-nCoV与蝙蝠冠状病毒非常相似，据推测蝙蝠是主要来源。尽管仍在调查2019-nCoV的起源，但目前的证据表明，是通过在华南海鲜批发市场非法出售的野生动物的传播造成的。

CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的，并在7年后首次用于生物化学实验，在2013年2月15日，张锋等人将CRISPR/Cas9系统成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑，此后迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。

世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒（例如2019-nCoV，埃博拉病毒，寨卡病毒，艾滋病病毒，流感病毒等），然而，这些病毒中只有2.5%具有可被Cas9靶向的DNA中间体，因此，使用RNA和DNA靶向的Cas9同源物显然不太可能满足这一需求，因为它们的RNA切割效率较低，并可能对细胞DNA产生脱靶效应。此外，这些致命的RNA病毒大多数没有FDA批准的治疗方法。因此，迫切需要开发新的抗病毒方法。

本项研究引入了一种新的样品处理方法，告别了实验室内繁复的核酸提取工作，使得新技术能够直接在患者唾液和血清样本中检测到病毒，同时依旧保持着1个拷贝/微升的灵敏度。该技术也能够更容易、快速地区分几种相关的类似病毒（如寨卡、登革热、黄热病毒和西尼罗河病毒），这些病毒引起的症状相似，对辨明疫情特别有用！

基于此前研究的基础，检测结果可以直观地展示在试纸上，整个过程只需要不到2个小时。这意味着，不需要复杂的设备，不需要高端的技术人员，在疫情来临时，普通的医务人员即可在现场快速确认毒株！

2019年10月10日，麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的Pardis C. Sabeti、张锋等人在Cell 子刊 Molecular Cell 杂志发表了题为：Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究论文。

研究人员将Cas13的抗病毒活性与其诊断能力结合起来，建立了一个强大和快速可编程的诊断和抗病毒系统，命名为CARVER (Cas13辅助的病毒表达和读出限制)，以检测和消灭人类细胞中基于RNA的病毒。该系统将来可能用于诊断和治疗病毒感染(包括由新病毒和新兴病毒引起的感染)。

为了探索新的抗病毒策略，研究人员将重点放在了Cas13上，它可以天然地靶向细菌中的病毒RNA。该酶可被编程去靶向RNA的特定序列，几乎没有限制，并且相对容易进入细胞，而且，Cas13已由包括Broad 研究所核心成员张锋在内的研究人员在哺乳动物细胞中进行了充分研究。

研究人员通过实验测试了Cas13在分别感染了三种不同RNA病毒的人类细胞中的活性：淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、甲型流感病毒(IAV)和疱疹性口炎病毒(VSV)。研究人员将Cas13基因片段和一种工程化的引导RNA导入细胞，24小时后，将细胞暴露在病毒中。再过24小时后，Cas13酶使细胞培养中的病毒RNA水平降低了多达40倍。

研究小组进一步研究了Cas13对病毒感染性的影响——换句话说，剩余的病毒有多少可以继续感染人类细胞。数据表明，在病毒暴露8小时后，Cas13将流感病毒的传染性降低了300多倍。

为了增加诊断需求，研究人员还采用了基于Cas13的核酸检测技术SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）。这个三合一的CARVER系统可以快速测量样品中病毒RNA的剩余水平。
注：SHERLOCK，由张锋开发并命名，同时，SHERLOCK是神探夏洛克·福尔摩斯（Sherlock Holmes）的名字。张锋简直是起名大师，总是能把名字和功能结合的这么完美。CARVER，Cas13-assisted restriction of viral expression and readout，同时，CARVER也有雕刻师的意思。

SHERLOCK术基于CRISPR/Cas13a系统，并结合重组聚合酶扩增技术（RecombinasePolymerase Amplification，RPA），能够对样本中痕量的核酸在恒温条件下进行大量扩增，从而满足Cas13a的检测需求。
该研究的第一作者 Catherine Freije 表示：“Cas13可以是一种研究工具，来探索人类细胞中病毒生物学的许多方面，它也可能是一种临床工具，用于诊断样本，治疗病毒感染，并衡量治疗的有效性——所有这些都能让CARVER在新的或耐药性病毒出现时迅速适应和应对。”

 

参考内容：
http://science.sciencemag.org/content/360/6387/444
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.013
http://science.sciencemag.org/content/360/6387/439