与疫情赛跑，一步法RT-qPCR快速筛查新冠病毒

　　多人死亡，往返中国的航班取消，潜在接触者被隔离，促使世界卫生组织（WHO）宣布起源于中国武汉的新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情被划入“国际关注的突发公共卫生事件”（PHEIC）。截至2020年2月10日，2019-nCoV引发的呼吸道疾病已导致全球1000余人死亡，4万余人确诊患病。

　　

与疫情赛跑，一步法RT-qPCR快速筛查新冠病毒

多人死亡，往返中国的航班取消，潜在接触者被隔离，促使世界卫生组织（WHO）宣布起源于中国武汉的新型冠状病毒（2019-nCoV）疫情被划入“国际关注的突发公共卫生事件”（PHEIC）。截至2020年2月10日，2019-nCoV引发的呼吸道疾病已导致全球1000余人死亡，4万余人确诊患病。
 
 
冠状病毒是一类能引起上呼吸道和下呼吸道疾病的病毒，具有类似太阳冠冕的特征性尖刺外观。许多常见的冠状病毒通常会导致轻度到中度的症状，但有些病毒会导致严重的症状，并可能发展为致命的肺炎，比如在2003年爆发的SARS-CoV 和2015年的MERS-CoV。由于2019-nCoV引发的肺炎导致多人死亡，且可能潜在的无症状个体传播，因此，对该病毒进行有效的实验室筛查对控制此次疫情至关重要。
 
2020年1月24日，中国疾病预防控制中心等权威机构发布了鉴定2019-nCoV的文献《A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019》。文章中，作者开发了一种病毒筛选方法，通过RNA-Seq技术获得了特异性病毒序列，对2019-nCoV进行测序和分类，还使用光镜和透射电镜观察了2019-nCoV感染的人呼吸道上皮细胞中培养物的病毒颗粒和细胞病变效应。这其中使用了Takara探针法One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）。
 
中国科学院武汉病毒研究所发表的文章《Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin》，已经鉴定出该病毒在整个基因组水平上与蝙蝠冠状病毒96%相同，对7种保守的非结构蛋白的成对序列分析表明，该病毒属于SARSr-CoV。重要的是，他们证实2019-nCoV使用了与SARS冠状病毒相同的细胞进入受体ACE2。该团队使用了Takara的SMARTer RACE 5'/3' Kit（Code No. 634858） 用于确定病毒基因组的5'末端序列。
 
另一个研究小组（Letko和Munster 2020）利用Takara高效率无缝克隆技术In-Fusion HD Cloning Kit（Code No. 639648）克隆了该病毒的刺突编码序列，研究了2019-nCoV的细胞进入机制。
 
类似的方法已经被许多组织用来识别这种特殊病毒的其他部分。中国疾病预防控制中心推荐了One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)（Code No. RR064）用于2019-nCoV的检测，并已经在中国各地被广泛使用。世界卫生组织（WHO）和疾病预防控制中心（CDC）已经开发出类似的方法，随着更多病例的报道，WHO将对病毒检测方法提出更多建议。

我们正迅速行动，以满足中国以及其他国家不断增加的2019-nCoV筛查需求。
Takara 愿以高质量的产品和热忱的服务，为2019-nCoV筛查贡献绵薄之力。
 

山川异域，风月同天。守望相助，众志成城。 

Takara提供2019-nCoV筛查完整解决方案

产品	Code No.	包装量	用途
DNA-OFF™	9036	500 ml	去除实验区域DNA污染
RNase-OFF™	9037	500 ml	去除RNase污染
TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0	9766	50 次	柱式法病毒核酸提取
RNAiso Plus	9108/9109	100/200 ml	试剂型Total RNA提取
One Step PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)	RR064A/B	100/500 次 （50 μl反应）	probe法One Step RT-qPCR
PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix	RR650A/B	200/1,000 次（25 μl反应）	无需RNA纯化，直接进行probe法One Step RT-qPCR
PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix, with UNG	RR651A/B	200/1,000 次（25 μl反应）	RR650的UNG版本，防止假阳性
One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix	RR600A/B	200/1,000 次（25 μl反应）	完全premix型probe法One Step RT-qPCR
One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, with UNG	RR601A/B	200/1,000 次（25 μl反应）	RR600的UNG版本，防止假阳性
Uracil DNA Glycosylase (UNG), heat-labile	2820	200 U	防止Carryover污染导致的假阳性
dU plus dNTP Mixture (12.5×)	4035	800 μl	防止Carryover污染导致的假阳性
dNTP Mixture	4030	各3.2 μmol/1.28 ml	PCR底物
dNTP Mixture	4019	各2.5 μmol/250 μl	PCR底物
Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)	2641A/B	10,000/40,000 U	反转录酶
Recombinant RNase Inhibitor	2313A/B	5,000/25,000 U	RNase抑制剂
T7 RNA Polymerase	2540A/B	5,000 U/25,000 U	RNA标准品的体外转录
RNase-free Water	9012	1 ml×10 支	RNA实验用水

除上述目录产品外，Takara不断完善病毒检测方案，提供WHO、中国疾病预防控制中心公布指导的引物探针套装、美国疾病控制与预防中心公布指导的引物探针套装。
同时，引物探针套装中还增加了所有检测靶点Control RNA产品。
 
一、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因、E蛋白基因、N蛋白基因检测套装：

序号	Primer/Probe名称*	碱基序列 (方向为5' to 3')*	5'修饰	3'修饰	Control RNA
01	2019-nCoV RdRP_SARSr-F2	GTG ARA TGG TCA TGT GTG GCG G			Ger-RdRP
02	2019-nCoV RdRP_SARSr-R1	CAR ATG TTA AAS ACA CTA TTA GCA TA
03	2019-nCoV RdRP_SARSr-P2	CAG GTG GAA CCT CAT CAG GAG ATG C	FAM	BHQ-1
04	2019-nCoV RdRP_SARSr-P1	CCA GGT GGW ACR TCA TCM GGT GAT GC	FAM	BHQ-1
05	2019-nCoV E_Sardeco-F1	ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT			Ger-E
06	2019-nCoV E_Sardeco-R2	ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A
07	2019-nCoV E_Sardeco-P1	ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG	FAM	BHQ-1
08	2019-nCoV N_Sarbeco_F1	CAC ATT GGC ACC CGC AAT C			Ger-N
09	2019-nCoV N_Sarbeco_R1	GAG GAA CGA GAA GAG GCT TG
10	2019-nCoV N_Sarbeco_P1	ACT TCC TCA AGG AAC AAC ATT GCC A	FAM	BHQ-1

二、新型冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab/N基因检测套装：

序号	Primer/Probe名称*	碱基序列 (方向为5' to 3')*	5'修饰	3'修饰	Control RNA
11	2019-nCoV nsp14F	TGG GGY TTT ACR GGT AAC CT			HK-ab1
12	2019-nCoV nsp14R	AAC RCG CTT AAC AAA GCA CTC
13	2019-nCoV nsp14P	TAG TTG TGA TGC WAT CAT GAC TAG	FAM	TAMRA
14	2019-nCoV NF	TAA TCA GAC AAG GAA CTG ATT A			HK-N
15	2019-nCoV NR	CGA AGG TGT GAC TTC CAT G
16	2019-nCoV NP	GCA AAT TGT GCA ATT TGC GG	FAM	TAMRA

根据中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所公布指导，Takara提供一个qPCR引物探针套装：

序号	Primer/Probe名称*	碱基序列 (方向为5' to 3')*	5'修饰	3'修饰	Control RNA
17	CDC 2019-nCoV ORF1ab-F	CCCTGTGGGTTTTACACTTAA			CDC-ORF1ab
18	CDC 2019-nCoV ORF1ab-R	ACGATTGTGCATCAGCTGA
19	CDC 2019-nCoV ORF1ab-P	CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG	FAM	BHQ-1
20	CDC 2019-nCoV N-F	GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT			CDC-N
21	CDC 2019-nCoV N-R	CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
22	CDC 2019-nCoV N-P	TTGCTGCTGCTTGACAGATT	FAM	TAMRA

根据美国疾病控制与预防中心公布指导，Takara提供一个qPCR引物探针套装：

序号	Primer/Probe名称*	碱基序列 (方向为5' to 3')*	5'修饰	3'修饰	Control RNA
23	US CDC 2019-nCoV_N1-F	GACCCCAAAATCAGCGAAAT			US-N1
24	US CDC 2019-nCoV_N1-R	TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG
25	US CDC 2019-nCoV_N1-P	ACCCCGCATTACGTTTGGTGGACC	FAM	BHQ-1
26	US CDC 2019-nCoV_N2-F	TTACAAACATTGGCCGCAAA			US-N2
27	US CDC 2019-nCoV_N2-R	GCGCGACATTCCGAAGAA
28	US CDC 2019-nCoV_N2-P	ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG	FAM	BHQ-1
29	US CDC 2019-nCoV_N3-F	GGGAGCCTTGAATACACCAAAA			US-N3
30	US CDC 2019-nCoV_N3-R	TGTAGCACGATTGCAGCATTG
31	US CDC 2019-nCoV_N3-P	AYCACATTGGCACCCGCAATCCTG	FAM	BHQ-1
32	US CDC RP-F（内参检测用）	AGATTTGGACCTGCGAGCG
33	US CDC RP-R（内参检测用）	GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
34	US CDC RP-P（内参检测用）	TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG	FAM	BHQ-1

*所有引物探针为HPLC纯化级别，客户可以根据需要选择合适的套装。
**Control RNA产品需单独订购，订购时请咨询各地代理商。
 
Takara还可以提供使用简便、性价比高、可靠的Real Time PCR仪Thermal Cycler Dice Real Time System III (Code No. TP950)。 除具有以往Takara PCR仪受到好评的友好操作软件外，还搭载触摸屏控制面板，可进行单机 (独立) 操作，以追求操作简便性。

特点介绍：
◇ 搭载触摸屏，可独立操作，支持英语/日语界面，仪器软件更加追求操作简便性。
◇ 可做高速定量PCR反应。
使用嵌合荧光染料检测法时，与试剂TB Green Fast qPCR Mix（Code No. RR430）搭配使用，TP950可完成快速定量PCR反应。
◇ 专为科研用户设计的便于操作的定量软件。