案例解析┃多肽药物纯化中如何实现对反相色谱柱的保护

　　在这里我们介绍两种不同生产方式的治疗性多肽，均在一个或两个RPC步骤上游引入CIEX纯化步骤，该纯化工艺可提供目标多肽纯度高达99％以上。

　　

治疗性多肽由于其分子量较小以及在人体中的良好耐受性，因此在制药化合物中占有重要地位，但它们必须满足严格的纯度要求。治疗性多肽可通过固相合成或在生物学模型系统中表达，但无论哪种方式生产的粗肽产物，均会产生大量工艺相关的杂质（例如失效序列，化学修饰，生物负荷等），需要在下游工艺中去除。

当前，反相色谱（Reversed-phase chromatography，RPC）是*常用的多肽纯化技术，但原始料液可能会污染色谱柱。如果在基于硅胶的高性能RPC步骤的上游引入阳离子交换色谱（Cation exchange chromatography，CIEX）步骤，则可大大减少杂质的负担，另外也可使目标肽的纯度大大提高。在这里我们介绍两种不同生产方式的治疗性多肽，均在一个或两个RPC步骤上游引入CIEX纯化步骤，该纯化工艺可提供目标多肽纯度高达99％以上。

多肽药物市场前景
 
治疗性多肽（2-50个氨基酸序列）因其在人体中的高功效，安全性和耐受性以及与蛋白质药物相比较低的复杂性和生产成本，作为医学候选物极具吸引力。治疗性多肽介于蛋白质药物与传统小分子疗法之间，实现了对包括癌症在内的许多疾病有前景的治疗方法。如今，市场上有许多用于临床的治疗性多肽。2017年，治疗性肽的全球市场规模为220亿美元，到2024年估计将超过500亿美元。因此市场对于高性能的多肽纯化策略有很高的需求。

多肽纯化

通常，*好使用组合的正交分离方法，从复杂的料液即粗肽中纯化生物分子。不同的多肽生产方法对与工艺相关的杂质提出了各种挑战。合成肽（固相合成或液相合成）料液包含例如截短，缺失和错误的化学修饰序列等杂质。常规合成的多肽通常*多合成50-60个氨基酸，序列越长，在下游的纯化中必须去除的错误序列就越多；而来自诸如大肠杆菌的基于细胞的表达系统的粗肽中，通常含有许多与宿主相关的杂质，例如脂质，核酸，内毒素等，这些杂质在初始样品预处理步骤后仍然存在。如前所述，至关重要的是*终的多肽产物必须具有所需的纯度才能用作治疗，这对纯化工艺提出了很高的要求。

RPC vs. IEX

反相色谱（RPC）是*常用的多肽分离技术。正如所有的纯化策略都有其自身的挑战和不足，高分辨率RPC昂贵且*常用的基质是硅胶，而硅胶使用氢氧化钠进行原位清洗（CIP）的选择受到限制，所以粗肽料液中的杂质容易造成难以清除的色谱柱结垢，这导致RPC树脂的寿命缩短。为了规避二氧化硅树脂的这些缺点并改善多肽分离，建议在RPC步骤的上游引入离子交换色谱（IEX）作为捕获步骤。可以更有效地分离多肽，还可通过IEX分离不能被RPC去除的多种肽修饰（例如，脱酰胺基和乙酰化）。

离子交换色谱（IEX）取决于色谱树脂上固定的离子交换基团与多肽带电基团之间的离子相互作用。阳离子交换树脂和阴离子交换树脂都已成功用于多肽纯化，其中阳离子交换树脂更为常见，但*终取决于多肽序列。

我们研究了在RPC步骤上游使用CIEX捕获步骤来增强多肽纯度，并同时实现保护下游敏感的RPC树脂的优势。研究了两种不同的情况：一种使用合成的粗肽料液，一种使用重组多肽料液（人胰岛素前体）。

案例一：合成多肽纯化

使用CIEX层析柱WorkBeads™ 40S（来自于Bio-Works公司）捕获45个氨基酸残基的合成药物多肽（pI 4.3-4.5），捕获步骤提高了*终多肽产物的纯度，并减少了负载在下游高性能硅胶色谱柱上的杂质。

阳离子交换色谱纯化合成多肽

使用WorkBeads™ 40S（来自Bio-Works公司）和Capto™ SP ImpRes（来自Cytiva，原GE healthcare公司）纯化包含55％纯度的多肽原料，以确定哪种树脂能提供纯度和产率的*佳组合，提前进行预纯化步骤，例如沉淀、过滤等，以获得起始原料，即55％纯度的料液。实验中针对CIEX捕获步骤优化了结合和洗脱条件，在15％乙腈条件下，pH 4结合，pH 6进行洗脱。上样量大约为20-25％的CIEX树脂的载量，以能够区分多肽中的杂质分离（尽管在工艺上，通常上样树脂更高百分比的DBC进行纯化）。两种不同的CIEX树脂上的分离纯化，请参见下图。 

与Capto™ SP ImpRes相比，以上色谱图中指示的主要目标肽峰在WorkBeads™ 40S上的分离度更高。色谱图中较早洗脱的所有多肽种类均为不完整的失效肽序列，即必须去除的杂质，在两个色谱柱上保持相同的产率（92％）收集目标肽。上样量为30 g/L时，WorkBeads™ 40S的纯度为91.8％，Capto™ SP ImpRes的纯度为85.2％（见下表）。当上样量降至10 g/L树脂时，WorkBeads™ 40S的纯度提高至93.0％。

然后，使用RPC反相色谱对从WorkBeads™ 40S洗脱的肽库进行精纯步骤，从而使该治疗性多肽的*终纯度达到99％（图4）。

小结

两种树脂均显示出优异的传质性能，与Capto™ SP ImpRes相比，WorkBeads™ 40S在载量和选择性（纯度/产率）方面显示出卓越的性能。在使用CIEX（WorkBeads™ 40S）和RPC组合后，使用WorkBeads™40S CIEX步骤后将RPC色谱柱上的负载杂质从45％降低到8.2％，目标肽的*终纯度达到99％，这是药物肽/活性药物成分（API）的要求。因此，WorkBeads™ 40S是在合成多肽纯化中的极佳选择，既可使目标肽的*终纯度提高，又可用于保护下游的RPC树脂。

案例二：重组胰岛素纯化

另外，针对在大肠杆菌中表达的重组人胰岛素前体（pI 4.5）进行了一项研究，该重组人胰岛素前体的标准纯化工艺涉及两步RPC，使用具有不同pH值不同缓冲系统进行互补选择性纯化。当上游引入CIEX步骤时，可进一步提高选择性。

阳离子交换色谱纯化胰岛素前体

包含72.5％的人胰岛素前体（Met-Lys-Human insulin）的料液可通过三步进行纯化。针对CIEX捕获步骤优化了结合和洗脱条件，在30％乙醇pH 4条件下，进行梯度洗脱，上样量约为DBC的14-16％。优化每个纯化步骤，合并组分，以90％的产率获得可能的*高纯度。

收集主峰以获得90％的收率，然后进一步处理。WorkBeads™ 40S和Capto™ SP ImpRes收集的产物纯度见下表。使用WorkBeads™ 40S的CIEX步骤将杂质从27.5％降至12％。与Capto™ SP ImpRes相比，使用WorkBeads™ 40S可以在**步中获得更高的纯度。

三步纯化胰岛素前体

将CIEX纯化的产物（WorkBeads™ 40S）经过RPC色谱柱上进一步处理，*终纯度为99.7％。第二步和第三步纯化步骤使用相同的RPC色谱柱（PK-C8-10µm-100Å）进行。表5中显示了三步纯化工艺的设置。表6显示了工艺中每一步纯化后的纯度。

三步纯化工艺中每个步骤的分析色谱图如下图所示，其中清晰地显示了逐步提高的纯度。

小结

使用WorkBeads™ 40S进行的捕获步骤将**根RPC色谱柱上的负载杂质从27.5％降低到12％。这种改进将显著减少RPC色谱柱的结垢，并减少原位清洗的需要，从而延长RPC树脂的使用寿命。该方法的*终纯度为99.7％，远高于99％的目标。与Capto™ SP ImpRes阳离子交换树脂相比，WorkBeads™ 40S显示纯度更高。

Summary

来自粗肽料液的杂质易于造成RPC树脂结垢，基于硅胶树脂的RPC稳定性不足以耐受除去杂质所需的氢氧化钠清洗，因此RPC色谱柱的使用寿命受到限制。不同生产方式带来了不同的污染物和杂质去除的挑战。通过在RPC步骤之前引入上游CIEX步骤，可以大大减少杂质的负担。两种不同的粗肽料液（固相合成肽和在细菌宿主中表达的重组人胰岛素前体）均显示了这一点。重组胰岛素前体料液会产生大量的生物负载，导致高分辨率RPC树脂大量结垢。

因此，引入CIEX作为正交纯化步骤的优点不仅提高了*终多肽产物的纯度，而且还去除了明显的杂质。由于琼脂糖基质的CIEX树脂可以耐受较高的氢氧化钠浓度，因此可以进行充分的原位清洗，并可以将树脂再生到其原始性能。

总而言之，WorkBeads™ 40S是在多肽纯化过程中作为RPC步骤之前的捕获步骤引入纯化工艺的绝佳选择，并且可用于实验室规模和工业规模的纯化。结果表明，在通过RPC进行*终精制之前，使用基于琼脂糖的正交阳离子交换步骤可以显着提高纯度。

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